生化分离 实验题目及答案

1、在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO?答:吸取水分，防止咖啡因蒸汽溶于水；中和鞣酸；索氏提取装置有哪几部分组成？（画图）咖啡因升华过程中用到了什么？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？答：用升华装置包括：蒸发皿、电热套、漏斗（滤纸、牙签、棉花）注意：1.要控制好温度，始终都需用小火间接加热，如温度太高，会使产物发黄。漏斗颈部棉花松紧适宜。滤纸的孔数适宜，也不能将滤纸放反了。若漏斗上有水蒸气应用滤纸擦干茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？答：旋转蒸发器、水浴锅、循环水式真空泵等动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？答：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然

2、后离心除去变性蛋白质，动物脏器DNA提取实验中，如何鉴定DNA的纯度？答：DNA在紫外区有强吸收，最大吸收波长为260nm，而Pro在280nm处有强吸收， 若其中含有Pro，则A260 /A280小于1.6，若含有RNA，则大于2.0，纯的DNA溶 液为1.8左右，据此可判断DNA纯度。动物脏器DNA提取实验中,RNA是怎样去除的？答：在浓NaCl溶液（12mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解 度很小；而在稀NaCl溶液（0.14mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核 蛋白的溶解度很大。将提取的细胞核物质先溶解与浓NaCl溶液中充分搅拌一定时 间后，加水稀

3、释，降低DNA溶解度使DNA沉淀出来，倒去上清即除去RNA。动物脏器DNA提取实验中,氯仿一异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？答：氯仿一异戊醇的作用使核蛋白乳化变性分三层：上层为DNA和DNA核蛋白的水层中间层为变性蛋白凝胶下层为氯仿-异戊醇的有机溶剂层动物脏器DNA提取实验中，为什么用0.1MNacl一柠檬酸间歇式的搅拌猪肝？答：与细胞等渗溶液，在搅碎时，保持细胞内外渗透压，防止细胞核破碎；间歇性搅拌 是为了避免搅碎细胞核（剪切力）离子交换层析分离鸡卵粘蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？ 用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？答:10%TCA去除杂蛋白预冷丙酮沉淀黏蛋白以得粗提取物

4、11.鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用的树脂是哪种？树脂为什么预处理？如何预 处理？答：1.DEAE一纤维素树脂去除交换剂中存在的杂离子使其充分溶胀DEAE 一纤维素一碱性溶液中浸泡一定时间一洗至中性一酸性溶液中浸泡一定 时间一水洗至中性一保存在缓冲溶液中备用补充：对于OH型：先碱洗，再洗至中性，再酸洗，再洗至中性。对于H型：先酸洗，再洗至中性，再碱洗，再洗至中性DEAE 一纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE一纤维素（OH型） 答：是阴离子交换剂；对于OH型：先碱洗，再洗至中性，再酸洗，再洗至中性。在鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验中保持系统pH值稳定6.5左右用意何在？ 答：实验

5、中用的离子层析柱，离子交换剂带正电荷，系统pH为6.5,能使目标蛋白带 负电，能与离子交换剂结合，使得杂蛋白带正电不能与离子交换剂结合，而使目标 蛋白与杂蛋白分离。简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图？答：恒流泵-离子交换柱-紫外检测仪-级分收集器离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），为什么提取液的水在3.5左右？答：黏性Pro在pH3.5不发生沉淀，能维持它的稳定性，而使杂蛋白带正电，TCA自身带负电，能与正电的杂蛋白结合使其变性，若pH再减小，TCA变形能力降低， 而且黏蛋白稳定性破坏，即3.5pH减少了目标pro的变性，增加了杂蛋白变性。离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下半部）P

6、H6.5的用意何在？答：洗脱杂蛋白质，使目标蛋白带负电，同时杂蛋白带正电（存在少量杂蛋白带负电）简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理？答:表面活性剂在有机相中自发形成反胶团，其内部有稳的水池，蛋白质溶解于小水池 中，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活。 改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相（反萃），实现了蛋白质的萃取分离、纯 化目的。栀子黄色素提取实验中，栀子苷是如何去掉的？为什么用此方法去除答：D101是非极性吸附剂，在极性溶液中对溶质的吸附作用大，对栀子黄色素的吸附 能力强，改为70%乙醇时，溶液极性变小，非极性树脂吸附乙醇而洗脱出栀子黄 色素，栀子

7、苷因不能被吸附而被去除。栀子黄色素提取实验中，如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况？答：分光光度法；栀子黄色素水溶液在A238/A440的比值情况，当比值小于0.2时，可 以避免绿变现象。大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的？答：大蒜滤液中加11.1倍体积去离子水，再分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙 醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置30min（4C），然后4000r/min 离心20min （5000rpm离心15min）除去变性蛋白沉淀，收集滤液，过滤（记录体 积，测酶活性核蛋白浓度）补充：向大蒜的提取液中加入体积比为3:5的氯仿-乙醇溶液，边加边搅拌，使

8、杂蛋白 变性，离心除去。大题（四选一）大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？并简要说明活性测定的原理，基本操作，注意事项以及数据处理？答：SOD抑制邻苯三酚的方法.邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出02 -，生成带色的中间产物， 反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是 因为生成的中间物不断氧化的结果。当有SOD存在时，由于它能催化02 -与 H+结合生成02和H2O2,从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求 出SOD的酶活性。反应方程式：基本操作：取3支试管（1号空白管,2号自氧化管，3号样品管），分别加入等 量Tris-HCl（pH8

9、.2），保持相等溶液体积VI，以1号管为空白对照，在2号中加入邻苯三酚，3号中加入邻苯三酚与V2SOD，分别测出在 波长325下的吸光值并作曲线求出斜率KA与KB数据处理：酶活（U/ml）=KAKBKA*100%50% *V1V2注意事项：液体配好后立即加入到比色皿中，等待1min开始测定吸光值 加入的量要精确设计实验从猪肝中提取RNA并鉴定其纯度。（原理，步骤，结果处理及结论） 原理：DNA在生物体内与蛋白质结合成核蛋白，因此提取出脱氧核糖核蛋白（DNP） 后，必须将其中蛋白质除去。在浓NaCl溶液（12mol/L）中，DNA核蛋白的 溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液

10、（0.14mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度 的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核 蛋白后，需进一步将蛋白质等杂志除去（采用氯仿-异戊醇使其乳化变性）。步骤：取猪肝，去结缔组织，加NaCl-柠檬酸钠间歇性搅拌，2层纱布过滤，离心，细胞 核沉淀，在1.71NaCl充分搅拌，静置，用蒸馏水稀释（勿搅拌），静置（细胞核 破碎），加NaCl固体粉末（RNA沉淀），静置，3000r/min离心，倒上清，将沉 淀用0.14MNaCl充分溶解，转入三角瓶加氯仿-异戊醇（充分振荡），3000r/min 离心，取上清加9

11、5%乙醇，将RNA沉淀挑取溶解鉴定。结果处理：以0.14MNaCl为空白对照记录260nm和280nm下的吸光值。 结论：A260A280=1.8为标准，小于1.6则含有蛋白质；大于2.0含有DNA。设计实验利用CTAB/异辛烷反胶团溶液萃取与反萃取甘薯中淀粉酶，并测定前萃取 率及总萃取率（原理，步骤，结果处理与结论）原理：利用阳离子型表面活性剂CTAB在有机溶剂中形成反胶团来萃取a -淀粉酶 （pI=5.0）。CTAB形成的反胶团内表面极性头带正电荷，当a -淀粉酶带净负电荷 时，由于静电引力作用，使其被萃取进入反胶团内，反之则不能；另外高能度得 盐离子可与蛋白质竞争进入反胶团内，因此造成萃

12、取下降。步骤：反胶团溶液制备f预处理f萃取f反萃取反胶团制备：正丁醇60C溶解后加入异辛烷混合，加0.5%NaCL缓慢加入，剧烈搅拌，离心取上相备用（反胶团溶液）预处理：取甘薯匀浆溶液静置后过滤，离心，取上清，分为两份（1号中加3M KCl作为原液，2号中加入0.5%NaCl作为萃取酶提取液。萃取：2号中加入反胶团溶液振荡离 心取上相（有机相）反萃取：萃取后的上相加入到3M KCl （pH6.6），振荡离心取下相（试样）酶活测定：取4只试管，依次编号（1号原液对照，2号原液，3号试样对照，4号试样），在1号和4号中分别加入等量预热的原液和试样，再加入等量的预热淀粉，40C精确保温，4只管种分别

13、加入DNS终止反应，1号与3号中分别加入等量原液和试样，沸水浴显色后稀释，测在波长540下，以1号测出2号原液的吸光值A原，以3号测出4号试样的吸光值A样结果处理：总萃取率=A样A原X100%结论:若答案为负值，则在操作过程总溶剂加错试管；正确来说4只比色皿的颜色由深到浅顺序为2143简要说明鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验（下半部）中，目标蛋白与杂质蛋白是 如何分离的。（说明原理，步骤，注意事项及所用设备组成图）原理：预处理使目标蛋白与交换离子带上相同的电荷,使杂质蛋白带上相反的电荷.离子 交换剂上的交换离子能与之相同电荷的溶质发生交换，溶质通过静电作用于固定 电荷结合而被吸附在离子交换剂上.待杂蛋白洗脱完毕后，用PBS使目标蛋白带 上与交换离子相反的电荷，将目标蛋白洗脱出来。步骤:样品预处理f柱的填装f柱的平衡f上样f杂蛋白洗涤一目标蛋白洗脱样品预处理:0.02MPBS（pH6.5）预处理样品液，离心取上清柱的填装：调稀离子交换剂缓慢均匀连续倒入柱内柱的平衡：用0.02MPBS（pH6.5）对柱进行洗脱，至基线平衡上样：将样品缓慢均匀倒入柱内（勿使柱内溶液流空）杂蛋白洗涤：0.02MPBS（pH6.5）洗涤杂蛋白