男性不育的试验室诊断及评价南京医科大学

1、男性不育的试验室诊断及评价南京医科大学维持男性生育的基本条件：（1）睾丸内产生足够数量的精子。（2）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。（3）输精管道通畅。（4）具有正常的性功能。（5）附属性腺功能正常。不育症诊断的步骤：1.病史采集: 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。2.体格检查：包括外生殖器和全身体检。3.实验室诊断4.特殊检查一、 精液常规分析精子（5%）精液组成 精囊腺液（60%）凝固因子、果糖精浆（95%）前列腺液（20%）液化因子 尿道球腺液（3%）睾丸液、附睾液 精子精液分段成分： 前段睾丸液，附睾液（精子），尿 道球腺液 中段前列腺液 后段精

2、囊腺液精液变量的参考值：精液量：26ml 颜色：灰白液化时间：60分 粘稠度：拉丝60% 活力： A+B50%或A25%精子计数：2000万/ml 畸形率：30% 脓细胞： 5个/HP （6ml病因：附属性腺感染附属性腺功能亢进2. 精液液化及粘稠度异常精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流动性大。 病因：精囊腺炎症精液不液化或液化不全：液化时间30分 病因：前列腺功能障碍3.精液pH异常： 测量方法：pH试纸(pH范围6.1-10.0 或6.4-8.0)pH过低 原因：输精管和精囊腺的缺如 附睾病变 pH过高： 原因：精囊腺液分泌过多 前列腺液分泌过少4.精子记数异常： 正常20106个/ml

3、测定方法：血球计数板一次性精子计数板 Makler精子计数板CASA仪1)少精子症：20106个/ml 严重少精子症：250106个/ml5.精子畸形：观察方法：吉姆萨染色法或瑞士染色法巴氏染色法布赖恩利什曼染色肖尔染色法畸形分类：头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头， 无定形头，空泡样头，双头等。颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等胞质残余体：常位于精子颈部白细胞检查： 正甲苯胺蓝过氧化酶染色法：结果：白细胞染成棕红色 联苯胺法：染料：联苯胺玫瑰红结果：白细胞褐色；其它细胞品红色。二精子运动特性的检测和分析1. 显微镜观察：注意事项：(1)取精液

4、10 ul，滴于玻片，盖上2222盖玻片，静置1 分钟后观察。(2) 控制温度，最好在37进行(3) 每次观察46个视野，计算100个细胞，计算A级、 B级、C级和D级精子的百分比，连续观察两张滴片， 误差不得10%。2.多点曝光技术：在1秒钟内对精子连续曝光6次，可判断精子的运动速度及运动轨迹。 精子运动速度分布： 快速： 25微米/秒 中速： 1025微米/秒 慢速：50个/HP或 A级精子20个HP影响因素：女方的内分泌状况。宫颈粘液中的白细胞。阴道pH，8.5可导致PCT异常。 宫颈结构异常。 抗精子抗体影响。 性功能异常,如阴道痉挛。精子质量差。2) 体外试验： 玻片试验 精子宫颈粘

5、液接触试验 毛细管试验: 穿透介质: 人宫颈粘液; 宫颈粘液代用品: 牛宫颈粘液; 含人血清精子营养液; 含牛血清白蛋白精子营养液; 鲜鸡蛋清;精子顶体酶测定（明胶膜法）：1)制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4湿盒备用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分钟。2)精子处理：取液化精液，用PBS稀释至24106个/ml。3)涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37湿盒2小时。4)观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。5)正常值：平均反应率65%，平均反应直径25m。6去透明带仓鼠卵穿透试验1)精子准备：精液充分液化调整精子浓度至10106个/ml精子获

6、能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空气中， 37孵育1824小时，调整精子浓度至4106/ml。2)卵细胞准备：取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG 3040U，4872 小时后再次注射HCG 3040U，18小时后输卵管内取卵。1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。3)体外受精：将0.1ml精液加至液体石蜡下，再加入2030个仓鼠卵，培养3小时。4)结果观察：相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为10%。三精液生化指标检测1. 酸性磷酸酶测定（ACP）原理：P硝基酚磷酸二钠ACPP硝基酚测定产生的P硝基酚含量，推测ACP的活性正常值：200U一次射

7、精意义：反映前列腺功能2.果糖测定：间苯二酚法原理：果糖间苯二酚加热红色化合物测定化合物含量意义：反映精囊腺功能与精子供能有关3.糖苷酶测定原理：麦芽糖糖苷酶葡萄糖测定葡萄糖含量意义：反映附睾功能四抗精子抗体测定1.常用方法：1)凝集试验：原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。试管玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）：将待检样本与液化的精液混合后，于孵育小时，显微镜下观察，出现条以上精子头头、尾尾或头尾连接即为凝集，观察个视野，个以上出现凝集即为阳性。圆盘凝集试验（Friberg）凝胶凝集试验（Kibrick） 缺点：假阳性高2)精子制动

8、试验（Isojima）：原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。3)直接免疫荧光试验：原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。4)免疫珠试验：原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。5）混合抗

9、球蛋白抗体试验（MAR试验）：原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA.6)酶联免疫吸附试验（ELISA）：原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有AsAb则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与AsAb结合，最后加入底物，产生颜色反应。优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定阳、阴性对照。五激素测定六遗传检测（一）染色体检查染色体的非整倍体）性染色体的非整倍体精子发生需要性染色体的平衡，即一个X和一个Y，X或Y的数目异常均可导致精子发生异常。(1) 47,XXY男性（Klinefelter

10、s syndrome），发生率1：500，睾丸发育不良，精子发生障碍；46,XY/47,XXY亦经常发生，伴有无精子或少精子。(2) 48,XXXY，49,XXXXY表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。(3) 46,XX男性：由于Y染色体的短臂（Yp11）异位到X染色体的短臂上（Xp22）。内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位，Yp11远端（SRY附近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。(4) 45,X男性，较少见，为Y长臂缺失，短臂异位至常染色体上（13,15,22常见）。(5) 47,XYY发生率1：750，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎

11、易死亡，或后代有异常染色体，4575%精母细胞带有二个Y。(6) YA平衡异位：Y长臂远端的异染区（Yq12）转移至端着丝粒常染色体的长臂上，Y长臂断裂在Yq11上，断裂部位对精子发生的影响较大，距Yq11较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距Yq11较远时，精子发生可正常并能生育，但带有YA异位的很易再断裂而引起不育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。2) 常染色体的非整倍体在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力男子的10倍。(1) 男性Turner氏综合征（Noonan 综合症）：为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为46, XY，或XO/XY嵌

12、合体。临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷，隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降，FSH和LH升高。21三体（Down综合症）：可生育或不育，多余的一条21可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（Sex vesicle）的形成。、3、9、10染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转，性腺退化，生精障碍。罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现1号染色体的非整倍体和XY精子的发生率是体细胞的10倍，如用XY精子行ICSI则可产生47,XXY的后代。已有报道，ICSI的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因此对行I

13、CSI的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前胚胎的遗传分析。（二）精子发生基因（Azoospermia factor, AZF）检测1.2. AZF的重要候选成分：YRRM1, DYS240, DAZ3. AZF与精子发生的关系：精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于500万ml）约有有AZF缺失4. AZF的检测方法：(1) 染色体原位杂交法(2) Southern Blot方法(3) PCR方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特点，便于临床推广应用，多重PCR可同时检测几AZF成分。(4) 单链构象多态性分析（Single Strand Conformation analysis, SSCP）检测AZF的点突变。(5) 核苷酸序列测定(6) 基因芯片技术5. AZF检测的意义：(1) 从基因水平揭示精子发生的机制。(2) 无精子症和严重少精子症患者的病因诊断。(3) ICSI的病例选择。(4) 为基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基础。人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，