微生物遗传与变异原理及方法

1、微生物遗传与变异原理及方法 通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。重点：细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖 微生物是理想的遗传学研究材料：物种及代谢类型的多样性；个体体制简单，营养体多为单倍体，基因组小；繁殖快，易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接和均匀；易变异、易得到营养缺陷型突变株；一般都有相应的噬菌体；存在着处于进化进程中的多种原始方式的有性生殖类等。基因组genome：一种生物的全套基因。表现型phenotype：生物可见

2、的或可测定的性状遗传型genotype：决定生物表现型的遗传因子同样遗传型的生物在不同外界条件下，会显现不同表现型，但遗传型并非改变，这种变异为非遗传性变异，只能称适应或饰变(modification)；只有遗传型改变，从而引起表型变化才称为变异，它发生在基因水平上，可以遗传给子代。Serretia marcescens在25下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜红色。可是，当培养在37下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25，产色素能力又得到恢复。第一节 生物遗传信息的载体证明DNA是遗传物质的经典实验1928年，F. Griffith；1944年O. T. Avery

3、 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）转化试验。1952年，A. D. Hershy、M. Chase的噬菌体感染实验。1956年，H. Fraenkel-Conrat的TMV拆开和重建实验。Griffith的转化实验转化因子的本质的阐明Hershey-Chase的噬菌体实验用35S和32P去分别标记大肠杆菌，然后再用T2噬菌体感染，即可分别得到标有35S和T2和32P的T2噬菌体。把标记噬菌体与其宿主大肠杆菌混合，经短时间(如10 min)保温后，使T2完成吸附和侵入过程。在组织捣碎器中剧烈搅拌，以使吸附在菌体外表的T2蛋白外壳脱离细胞并均匀分布。进行离心沉淀，再分

4、别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部的32P都和细菌一起出现在沉淀物中，而几乎全部33S都在上清液中。这意味着噬菌体的蛋白外壳经自然分离后仍留在细胞外部，只有核酸芯子才进入宿主体内；同时，由于最终能释放出一群具有与亲代同样蛋白外壳的完整的子代噬菌体，说明只有核酸才是其全部遗体信息的载体。后来通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。TMV重建实验遗传物质在细胞中的存在方式真核生物DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是

5、单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。原核生物DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒plasmid原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。DNA的双螺旋结构图遗传信息的传递和基因表达基因geneDNA分子的一定区段，携带特定的遗传信息，是具有自主复制能力的遗传功能单位。遗传信息通过DNA连上的核苷酸排列顺序表现出来。结构基因决定多肽形成的碱基顺序称结构基因，一个结构基因表达

6、后，产生一个多肽；即“一个基因一个酶”。调节基因对结构基因起调节控制作用的称调节基因。操纵子学说基因的表达以DNA为模板，通过RNA聚合酶转录出mRNA，然后将mRNA包含的碱基顺序在核糖体中翻译成相应氨基酸序列的多肽。转录（transcription）双链DNA单链，以其中一条为模板互补mRNA翻译(translation)mRNA 多肽第二节 原核微生物的基因重组克隆clone不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组gene recombination两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同

7、于亲本的新性状。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。转化Transformation 定义不经其它媒介，来自供体（donor）的DNA片段或质粒DNA直接进入受体菌（recipient或receptor） ，并在受体中复制、表达的过程。转化过程受体细胞呈现感受态，即容易接受外源DNA的生理状态。外源DNA与感受态细胞结合并被吸收。外源DNA整合到受体菌中，成为受体菌染色体的一部分。转染 transfection指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。转化示意图转导transduction 定义通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，

8、把一个供体细胞的 DNA 片段转移到另一个受体细胞中，并使后者发生遗传变异的过程。通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子（transductant）。携带供体部分遗传物质（DNA 片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。 1952 年Zinder 和 Lederberg 在验证Salmonella typhimurium是否也存在接合现象时发现了转导现象。S. typhimurium：LT22A (trp-)； LT2(his-)LT22溶原性噬菌体P22 感染LT2（非溶原性）可能释放带trp+的P22LT22A (trp-)呈原养型。普遍转导(generalized t

9、ransduction)噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)，并使受体菌实现各种性状的转导完全普遍性转导 complete transduction 形成了遗传性稳定的 转导子(transductant)流产普遍性转导简称流产转导(abortive transduction)，在许多获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到了表达。 能在选择性培养基 平板上形成微小菌 落成了流产转导的 特点。局限转导specialized transduction当溶原菌群经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产主错误切割，从而把宿主的某些基因（

10、 前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio，故形成的转导噬菌体通常带有ga1或bio）整合到噬菌体的基因组上 ，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，而形成转导子（缺陷溶源菌）。噬菌体DNA的不正常切割丢失了自身部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体称为缺陷噬菌体（defective phage）。如dgal或dbio。低频转导（1ow frequancy transduction, LFT），形成转导子的频率很低，只有10-4 10-6 。 高频转导（high f

11、requancy transduction, HFT ），形成转导子的频率很高, 理论上可达 50%。 高频转导是双重溶源的结果： E.coli k12 E.coli K12(/dgal )F dgal UV 转导噬菌体（gal） 转导子菌落 辅助噬菌体（） 噬菌斑 溶源转变(lysonenic conversion)当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象。当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，

12、而不是缺陷的。溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株。接合conjugation通过供体菌与受体菌间细胞相接触而传递大段DNA的过程。1946年，Lederberg和Tatum的E.coli k12营养缺陷型株混合培养实验中发现。E.coli k12两个突变株bio- met- the+ leu+bio+ met+ the- leu-两种菌混合培养后，出现 原养菌（bio+ met+ the+ leu+） 可在基本培养基上生长。细菌接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。大肠杆菌

13、是有性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(即致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色体组上；它既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、利福平、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。F因子的分子量为5107。在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%。F 因子的存在方式及其相互关系 F+菌株 含F质粒，细胞表面产生性毛(sex pili)，与F-细胞相连，在接合后转移DNA。 F-菌株 无F质粒，不 产生性毛，可 接受

14、外来F质粒。Hfr菌株高频重组菌株（high frequency recombination）。与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。在Hfr细胞中，存在与染色体特定位点相整合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F-菌株发生接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100 min。在转移时，由于断裂发生在F因子中，所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后，F因子才能完全进入F-细胞。但转移过程中断，所以越在前端的基因，进入的机会就越多，故在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。F菌株当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体

15、组时，可形成游离的携带一小段染色体基因的F因子，特称F因子。携带有F因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F菌株。初生F菌株与F-菌株接合，可使后者转变成F菌株，这就是次生F菌株，它既获得了F因子，又获得了来自初生F菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction) 。在次生的F群体中，大约有10%的F因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。原生质体融合 通过人工的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合并产生重组体的过程称为原生质体融合（protoplast fusion）。微生物细胞融合的研究开始于

16、1976年。其一般原理和主要过程是：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。基因转座 gene transposition转座子的特征是在两端有IR序列 ，分两类：型Compound transposons：两端为IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。型Complex transposons：两端为IR(

17、3050bp)，中间为转座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。第三节 真核微生物的基因重组 有性杂交 准性生殖 准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。粗糙脉孢菌的有性杂交准性生殖：准性生殖包括下面四个过程菌丝联结，异核体形成，核配体细胞交换和单倍体化四个阶段。第四节 微生物基因突变和诱变育种 基因突变突变（mutation）指DNA顺序上核苷酸发生置换或其它顺序上的改变。突变类型碱基对置换substitution 转换transition： 颠

18、换transversion：移码突变frame-shift mutant染色体畸变chromosomal aberration deletion、duplication、insertion、translocation、inversion基因突变表型形态突变型生化突变型营养缺陷型auxotroph；抗性突变型；抗原突变型致死突变型 条件致死突变型 其他突变型如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等。基因突变的特点不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性 正向突变(forward mutation)回复突变 (back matation或reverse mutation）基因突变的自发性和不对应性的证明一种观点认为，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”、“驯化”。另一种观点认为，基因突变是自发的。实验证明：1943年S. E. Luria与M. Dlbruck进行了Fluctuation test。1949年H. B. Newcombe的Respreding plated incubacion。1952年J. Lederberg夫妇用Replica- plating