环境因素对亚油酸异构酶的影响

1、实验项目：异常环境因素对乳酸菌不同种 间亚油酸异构酶影响的研究1一、实验目的： 本项目拟采用微生物细胞超声波处理、亚油酸异构酶蛋白的提取、凝胶过滤纯化、SDS分析等实验技术，对正常环境条件下和异常环境条件下培养的乳酸菌细胞中的亚油酸异构酶进行研究，从而阐明环境因素对乳酸菌不同种间亚油酸异构酶酶活和酶分子的影响。实验有助于深入了解环境因素对细胞生物活性所造成的影响。2二、实验原理1、微生物可以产生亚油酸异构酶，该酶具有专一性，可将亚油酸(LA)转化，得到较纯的、高活性共轭亚油酸(CLA)异构体-c9，t11及t10，c12-CLA。这两种异构体具有抗癌、抗粥状动脉硬化、降低体内脂肪和固醇含量、抗

2、氧化、促进生长、缓和免疫副反作用，所以研究乳酸菌亚油酸异构酶具有重大意义。32、本项目将研究环境因素(异常恶劣的物理和化学因素)对不同乳酸菌菌株亚油酸异构酶的影响。本实验首先分别对在正常条件下培养和异常环境条件下培养的各乳酸菌菌株采用超声波破壁，冷冻离心获粗酶液，测定其酶活力。该粗酶液经盐析、透析、Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化，再采用不连续SDS-聚丙烯酰铵(PAGE)检测不同环境条件下各菌株亚油酸异构酶的纯度、活力和测定分子量，进而分析异常环境因素对乳酸菌不同种间亚油酸异构酶的酶活和酶分子影响。43、亚油酸异构酶活测定，将该酶液作用于亚油酸后，经正已烷萃取，用分光光度计测定2

3、33nm处的吸光值，再对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量。 一个亚油酸异构酶活力单位U定义为： 1h内生成1g CLA所需要的酶量定义为一个酶活力单位。 KG酶活力(U/ml)= VT式中，K为酶液稀释倍数；G为所生成的共轭亚油酸量(g)；V为吸取酶液体积(测定时取0.2ml)；T为反应时间(h)。5实验技术路线：1、乳酸菌在正常环境条件下培养测定亚油酸异构酶菌种活化细胞正常环境条件下的培养细胞收集细胞破碎硫酸铵分段盐析透析聚乙二醇(PEG)浓缩Sephadex G-100凝胶过滤层析真空冷冻干燥酶纯度鉴定及分子量测定62、乳酸菌在异常环境条件下培养测定亚油酸异构酶菌种活化细胞异常环境条件下的培

4、养细胞收集细胞破碎硫酸铵分段盐析透析聚乙二醇(PEG)浓缩Sephadex G-100凝胶过滤层析真空冷冻干燥酶纯度鉴定及分子量测定73、分析比对在两环境中各乳酸菌种间亚油酸异酶酶活和酶分子量的异同8三、实验所需器材1、实验用菌株：1 ) 植物乳杆菌（Lactobacellus plantarum) A S 1.557 培养温度300C2 ) 嗜酸乳杆菌 （Lactobacellus acidophilus) AS 1.1854 培养温度370C92、仪器设备电热恒温培养箱、厌氧培养箱、振荡培养箱、电子天平、水浴锅、JY92-II超声波细胞破碎仪、Biofuge台式高速冷冻离心机、UV-245

5、0紫外-可见光分光光度计、UV-1600紫外可见分光光度计、GL-20G高速冷冻离心机、BT1-100恒流泵、HD-21-88紫外检测器、SBS-100数控计滴自动部分收集器、DYY-11型电泳仪、DYCZ-24E型电泳槽、脱色摇床、真空冷冻干燥机10四、实验安排实验人数：32人，安排5-6人/组，共6组。分任务分配植物乳杆菌组（正常环境条件组、异常物理条件组、异常化学条件组）；嗜酸乳杆菌组（正常环境条件组、异常物理条件组、异常化学条件组）11实验总学时：80学时 授课16学时：1、实验原理介绍、教授学生查找资料、设计实验方案（8学时）2、讲授研究论文的写作方法、撰写论文（8学时） 12 实验

6、64学时：内容一、菌种活化、正常条件下的细胞培养以及异 常条件下细胞的处理及培养（16学时）内容二、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶粗酶 液的提取及酶活测定（16学时）内容三、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶的 纯化及酶活测定（16学时）内容四、凝胶电泳鉴定分析不同菌种、不同环境条 件下各细胞亚油酸异构酶分子量以及酶活 力的测定（16学时） 13五、实验内容内容一、菌种活化、正常条件下的细胞培养以及异常 条件下细胞的处理及培养 实验步骤：冷冻菌种12%脱脂奶活化培养第二次12%脱脂奶活化培养转接至MRS液体培养基试管中转接至MRS液体培养基三角烧瓶中 按2%接种量接入产酶培养液中分别置于正常环

7、境条件下和异常条件下进行产亚油酸异构酶的诱导培养。141、配制培养基 种子培养基：用脱脂奶粉配成1 2%的脱脂乳培养基，分装在大试管内，每装10 mL、115灭菌15min。（配制200 mL） MRS固体培养基：酪蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母提取物0.5g、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5g、柠檬酸二铵0.2g、吐温80 1g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.005g、碳酸钙2g、琼脂1.5g ，蒸馏水100mL，加热搅拌均匀后，调节pH 值至6.8，分装在试管内，装液量为试管的三分一，121灭菌30min。（配制200 mL）15 MRS液体培养基：酪蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵

8、母提取物0.5g、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5g、柠檬酸二铵0.2g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.005g、蒸馏水100mL，加热搅拌均匀，调节pH 值至7.0，分装在250 mL 三角瓶中，每瓶装180 mL，121灭菌30min。（配制1000 mL/组，剩余培养液分装在试管内。） 产酶培养基：180 mLMRS无菌液体培养基，接种时加入20 mL亚油酸乳浊液。162、配制试剂： 甘油液：用蒸馏水配制50%的甘油100mL，混匀，1210C，灭菌30min。 亚油酸乳浊液：亚油酸吐温80水=1198（体积比）500mL/大组，装入三角烧瓶内， 115灭菌15min 。3

9、、无菌器皿的准备： 将移液枪头装入枪头盒中，1210C，灭菌30min。174、菌种培养： 菌种的活化培养：用移液枪吸取少许甘油管保存的菌株（或冷冻保藏管菌粉），接入到12的脱脂奶中，37和30 ，24h培养活化，活化两次。再转接至MRS液体培养基中，37和30 ，培养24 h再活化一次。 菌种的斜面保藏：用接种环取MRS培养液菌种转接到MRS斜面培养基上，37和30 ，厌氧培养24 h，置冰箱备用。18 菌种的甘油保藏：用移液枪取MRS培养菌液0.5mL放入EP管内，再取0.5mL甘油液放入同一EP管内，混匀，置-700C低温保藏。 乳酸菌液体菌种的培养：用接种环取MRS培养液菌种转接到MR

10、S液体培养基上，37和30 ，培养24 h，置冰箱备用。195、不同环境条件下的二菌株的产酶培养 二乳酸菌株在正常环境下的培养 取5个分别装有180 mL/ 250 mL无菌MRS液体培养基，无菌操作加入20 mL亚油酸乳浊液，即为产酶培养液。并按2%接种量将预先培养好的液体种子接入产酶培养液中，37和30 ，厌氧培养36 h。20 二乳酸菌株在恶劣物理环境下的培养 取5个分别装有180 mL/ 250 mL无菌MRS液体培养基，无菌操作加入20 mL亚油酸乳浊液，即为产酶培养液。取预先培养好的液体种子倒入无菌平皿中，置紫外灯下照1min，并按2%接种量将接入产酶培养液中，37和30 ，厌氧培

11、养36 h。21 二乳酸菌株在恶劣化学环境下的培养 取5个分别装有180 mL/ 250 mL无菌MRS液体培养基，无菌操作加入20 mL亚油酸乳浊液，即为产酶培养液。在产酶培养基中加入亚硝酸钠，添加量为0.2g/ mL，然后按2%接种量将预先培养好的液体种子接入产酶培养液中，37和30 ，厌氧培养36 h。22内容二、不同培养条件下各菌株亚油酸异酶粗酶液 的提取及酶活测定实验步骤：配制试剂制作共轭亚油酸标准曲线培养液中乳酸菌细胞的收集细胞破碎处理获得粗酶液粗酶液亚油酸异构酶酶活的测定23配制试剂生理盐水：100 mL 10%的溶菌酶：取溶菌酶2g溶于20mL的生理盐水中。0.2mol/L磷酸

12、氢二钠: 1000mL/大组 Na2HPO4相对分子质量=141.980.1mol/L柠檬酸: 1000ml/大组C6H8O7H2O相对分子质量=210.1424 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制 pH 0.2mol/L磷酸氢二钠(ml) 0.1mol/L柠檬酸(ml) 4.0 7.71 12.29 5.4 11.15 8.85 6.0 12.63 7.37 6.4 13.85 6.15 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)：1000mL/大组 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.4)：200mL/大组252、共轭亚油酸标准液的配制及紫外吸收标准曲线的制作（分大组制备） 共轭亚油酸标准液：取共轭

13、亚油酸（CLA）的标准品12.5mg(96%，Sigma公司)，用正己烷定容于25ml的容量瓶中，制成0.5mg/ml的原液。26共轭亚油酸标准曲线的制作 取共轭亚油酸标准原液(0.5mg/ml) ，用移液枪分别移取40、80、120、160、200、240l的原液于6个10ml的容量瓶中，用正己烷定容。振荡后，以正己烷为参比，用UV-1600紫外可见分光光度计，测定个样在最大吸收波长234nm处的吸光度，每组平行做2个分光测试试验。以CLA的浓度为横坐标，以平均吸光度为纵坐标，建立标准曲线及回归方程。273、乳酸菌细胞的收集 取培养液，离心(4500r/min，30min)收集细胞，用0.9

14、%的生理盐水振荡洗涤，离心(4500r/min，30min)两遍，倾去上清液沉淀即为湿细胞。284、细胞超声波破碎处理获得粗酶以1：4(W/W)的比例将湿细胞加入至磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)中，混匀10 min，于冰浴中用超声间歇破碎(超声波处理条件为400W，超声处理5s，间歇10s，45次)。在超声处理后的细胞悬液中加入至终浓度为1%的溶菌酶，混匀，室温下消化1.5h。然后再用上同样条件对细胞再次进行破碎(超声波处理条件为400W，超声处理5s，间歇10s，45次)。移入塑料试管中置-180C冰箱备用。29取出试管解冻，4下8 000 r/min冷冻离心30 min，收集上清液

15、，即为粗酶液 。取2L粗酶液分装在15L塑料离心管中，其余液体分装在另一塑料试管中，置-180C冰箱备用。305、测定粗酶液中的亚油酸异构酶酶活力1）取2ml粗酶溶液试管解冻后，加入2ml 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.4)溶解，再加5mL的亚油酸及1mL的吐温80，加塞，混匀10min，置于44摇床（200r/min）保温酶转化10 h。312）将酶转化液移入60mL梨形分液漏斗中，并用5mL正己烷洗涤试管后一并倒入分液漏斗中。然后加入25mL正己烷振荡萃取10分钟。静置分层后放弃下层水相液体，加入10mL蒸馏水振荡水洗，静置后弃去下层水相液体，水洗三遍后，萃取液移至干净试管中。323）

16、取垫有滤纸的直径为50mm的小漏斗盛装少量无水硫酸钠，将萃取液通过无水硫酸钠以吸去萃取液中的水分和水溶性物质，直至无乳化层止。将吸去水分和水溶性物质的正己烷萃取液移入25mL容量瓶中，加入正己烷定容，摇匀，在234 nm处测定其吸光值，对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量。 此次测得的吸光值均为3.00，其原因是经无水硫酸钠处理后萃取液仍很混浊，有乳化层存在。可能与亚油酸和T-80浓度高、静置分层不充分有关。334）计算酶活力，一个亚油酸异构酶活力单位U定义为，1 h内生成1g的共轭亚油酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位。 KG 酶活力(U/ml)= VT式中，K为酶液稀释倍数；G为所生成的共轭亚

17、油酸量(g)；V为吸取酶液体积 ；T为反应时间(h)。34内容三、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶的 纯化及酶活测定实验步骤：配制试剂饱和（NH4）2SO4分级沉淀透析袋预处理 透析除盐聚乙二醇20000 浓缩处理测酶活及蛋白质浓度 Sephadex G-100凝胶过柱层析（Sephadex G-100凝胶处理装柱、柱平衡、加样 过柱） 紫外检测、收集、测酶活聚乙二醇20000 浓缩处理测酶活及蛋白质浓度冻干保存351、配制试剂 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)： 2000 mL /大组 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.4 )： 100 mL /大组 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH

18、6.0 )： 3000 mL/大组 1mol/L BaCl2： 200mL/班362、饱和（NH4）2SO4分级沉淀 在粗酶液中添加经过研磨的硫酸铵，至饱和度为40%，4静置5小时后，离心(8000r/min，30min，4)，移出上清液(粗酶液)并计量体积；在冰水浴条件下，再向上清液加入硫酸铵至饱和度为80%的4静置过夜，离心(10000r/min，20min，4)收集沉淀。373、透析除盐1）将经硫酸铵盐析所得的酶沉淀用23倍体积的pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后装入经过预处理的透析袋(D16mm，透析分子量8000Da，剪成1520cm长的片断)，扎紧后浸入装有pH4.0磷

19、酸氢二钠一柠檬酸缓冲液的大烧杯中，4下磁力搅拌，透析除盐。382）开始每隔4h左右更换一次缓冲液，几次后可适当延长换液的间隔时间。用1mol/L BaCl2溶液检查脱盐情况，至无沉淀产生时即认为透析达到平衡。3）将上述装有酶液的透析袋直接填埋于装有聚乙二醇20000的烧杯中，放入冰箱内观察脱水情况，直至酶液样品浓缩到需要的体积。394、测定粗酶液中的亚油酸异构酶酶活力1）配制亚油酸乳浊液 称取50mg的亚油酸加入10mg的T-80，振荡混匀10min，移入50mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，得到含亚油酸、T-80 为1mg/mL和0.2mg/mL 的乳浊液，置冰箱保存。402）取1ml已透析除盐

20、的粗酶溶液，1mL亚油酸乳浊液，18mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.4)于100mL三角瓶中（0.05mg/mL亚油酸），振荡混匀10min，置于38摇床（200r/min）酶转化20h。3）取酶转化液5mL移入60mL梨形分液漏斗中，加入20mL正己烷振荡萃取10分钟。静置分层后放弃下层水相液体，加入5mL蒸馏水振荡水洗，静置后弃去下层水相液体，水洗一遍。413）取垫有滤纸的直径为50mm的小漏斗盛装少量无水硫酸钠，从分液漏斗瓶口将萃取液倾出，使之通过无水硫酸钠以吸去萃取液中的水分和水溶性物质，直至无乳化层止。将吸去水分和水溶性物质的正己烷萃取液移入25mL容量瓶中，加入正己烷定容，摇

21、匀，在234 nm处测定其吸光值，对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量。424）计算酶活力，一个亚油酸异构酶活力单位U定义为，1 h内生成1g的共轭亚油酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位。 KG 酶活力(U/ml)= VT式中，K为酶液稀释倍数(20)；G为所生成的共轭亚油酸量(g)；V为吸取酶液体积(1ml) ；T为反应时间(20h)。435、蛋白质浓度的测定1）制备蛋白质标准溶液 精确称取50mg牛血清白蛋白，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.4 )溶解，定容至50mL，即得1mg/mL标准蛋白质溶液。 442）标准曲线的制定 取8支试管，分别加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、

22、3.0、3.5、4.0mL标准蛋白质溶液，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.4）补足到4mL，混匀。选用光程为1cm的石英比色池，在280nm处测定各管溶液的光吸收值。以蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，光吸收为纵坐标绘出标准曲线作为蛋白质定量的依据。453）样品蛋白质浓度的测定 取透析浓缩液0.5mL，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.4 ) 4.5mL溶解，按上方法测定280nm处的光吸收值，即可从标准曲线上查出样品蛋白质的浓度（mg/mL）。466、Sephadex G-100凝胶过滤层析1）称取Sephadex G-100 5.0克于烧杯中，加入400mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

23、( pH6.0 )，于水浴锅中煮沸2小时，倾去细颗粒。472）柱内先充满磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( pH6.0 )洗脱液，然后在搅拌下缓缓而连续地加入浓稠的Sephadex G-100凝胶悬液，使之自然沉降，直至达到所需高度为止。（通常样品体积为凝胶床总体积的1-10%，制备时样品量可达20-30%，加样量为2mL） 注意：不能有气泡或裂纹出现。483）待凝胶沉集后，将多余的溶剂放出，使液面刚好与凝胶表面一致。然后在凝胶表面放一片滤纸或薄尼龙布，以防使用时凝胶被冲起，再通过2-3倍凝胶床体积的洗脱剂磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( pH6.0 )使柱稳定。 注意：柱装好后，任何时间都不能使液面低于凝

24、胶表面，否则会影响分离效果。494）用滤纸条吸去柱中表面多余的缓冲液，溶剂液面恰好与凝胶表面相平时加样。用移液枪加入2ml浓缩酶液，当样品进入凝胶床，样品液面到达凝胶床表面时，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( pH 6.0 )洗脱液洗脱，流速0.1 mL/min。505）自动收集经过紫外检测仪检测的洗脱液，每管2ml。纪录每管吸光度A280nm，然后以洗脱液的体积(管号2.0)为横坐标，以洗脱液在A280nm处的吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。对于吸光度值较大的洗脱液，测定酶活和蛋白质浓度（方法同前4、5）。透析袋收集酶活力较大的几管洗脱液后，扎紧，用聚乙二醇20000浓缩，移入EP管中备用。51内

25、容四、凝胶电泳分析不同菌种、不同环境条件 下二菌株亚油酸异构酶分子量大小的区别实验步骤：配制试剂不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析比较521、配制试剂30%丙烯酰胺凝胶贮备液：称取30g丙烯酰胺（Acr）， 0.8g亚甲基双丙烯酰胺（Bis），溶于双蒸水中，并定容至100mL。装于棕色瓶中，置40C冰箱，可保存1-2个月。10%过硫酸铵：称取过硫酸铵1g，溶于10mL双蒸水中，用前配制。10% SDS溶液：取10g SDS（十二烷基硫酸钠） 溶于80mL双蒸水中，并轻缓搅拌，定容至100mL，室温存放。53 1.5mol/L Tris HCl，pH8.8分离胶缓冲液：称取18.15g 三羟甲

26、基氨基甲烷(Tris)，用60ml双蒸水溶解，再用1mol/L HCl调节至pH8.8，然后定容至100mL，40C冰箱保存。 0.5mol/L Tris HCl，pH6.8浓缩胶缓冲液：称取6g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），用60ml双蒸水溶解，再用1mol/L HCl调节至pH6.8，然后定容至100mL,40C冰箱保存。54 样品缓冲液：分别取双蒸水4mL，0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 缓冲液1.0mL，甘油0.80mL，10%SDS 1.6mL，巯基乙醇0.4mL， 0.1%溴酚蓝0.2mL，总体积为8mL。 电极缓冲液（pH8.3)：称取3g Tris，14.4g

27、甘氨酸，1g SDS，用水溶解后，定容至1000mL， 40C冰箱保存。55 染色液：取1g考马斯亮蓝R250，溶于250mL甲醇及100mL冰醋酸中，溶解后定容至1000mL。 脱色液：250mL甲醇（或乙醇）和100mL冰醋酸混匀后，定容至1000mL。 1.5%琼脂：称取琼脂条1.5g，加入电极缓冲液100mL，煮沸溶解。（封电泳槽缝隙用）562、配制分离胶（配制总体积为10mL的胶/大组）15%12%10%7.5%双蒸水4.68mL6.68mL8.03mL9.68mL分离胶缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL10%SDS200L200L200L200L30%丙烯酰胺凝胶溶液1

28、0mL8.0mL6.66mL5mL10%过硫酸铵100L100L100L100LTEMED20 L20 L20 L20 L总体积20mL20mL20mL20mL注意：10%SDS使用前用微波加热溶解573、配制浓缩胶(4%) （配制总体积为5mL的胶/大组）双蒸水 3.0mL0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 1.25mL10% SDS （ 使用前用微波加热溶解） 50L30% 丙烯酰胺 0.67mL10%过硫酸铵 25 LTEMED 5 L总体积 5mL584、蛋白质样品的处理1）标准蛋白质样品的处理 称取标准蛋白质样品1mg，按1mg/mL溶液比例加样品缓冲液溶解，将其转移至带

29、塞的小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在沸水浴中加热3min，取出冷却。 2）待测亚油酸异构酶蛋白样品的处理 取浓缩后的酶蛋白质样品，按 1：1溶液比加入样品缓冲液，将其转移至带塞的小离心管中，其余操作同上述。 595、灌胶、聚合及安装电泳槽1）清洗玻璃板 将垂直平板电泳二块长短不等的凝胶玻璃模板取出，用海绵和洗洁精洗净，直止不挂水珠，烘干。将制胶模板框以及海绵条取出洗净，一并用滤纸吸干。602）安装制胶模板 将洗净干燥的两块长短玻璃板底部对齐，长玻璃的UP端朝上，短玻璃向外嵌入制胶槽中，卡住制胶槽。把制胶槽放在制胶框上，制胶槽底部压在海绵条上，长玻璃顶部用夹子卡上。613

30、）灌胶 灌分离胶 用注射器抽取配好混匀的分离胶液约3.5ml，沿着长玻璃板的内面缓缓注入至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度为留出梳齿高加1cm的空间，以便灌注浓缩胶。用移液枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层双蒸馏水（约3-4mm），用于隔绝空气使胶面平整，静置凝胶聚合（约30min-40min，或370C干燥箱放置聚合止）。62 灌浓缩胶 当水封层与凝胶面之间出现明显界面时，倾去水封层的蒸馏水，用滤纸条吸去多余的水，勿碰破胶面。用移液枪抽取配好混匀的浓缩胶液，加至到分离胶上，距短玻璃上缘0.5cm处止，在胶层顶部轻轻插入梳齿状样品槽模板，静置待聚合（约20min ）后，轻轻取出梳齿状样品槽模

31、板。634）安装电泳槽 将已制好的凝胶板从制胶框中取下，短玻璃朝内长玻璃朝外嵌入电泳凹槽内，然后将电泳凹槽放进电泳槽中，分别在电泳的内槽和二外槽注入振荡摇匀的pH8.3电极缓冲液，内槽要使液面（注意：泡沫不能算高度）没过短板玻璃，二外槽液面盖过电极丝2cm，放上加样器，即可加样。646、点样 用微量注射器取标准蛋白质样品和待测酶蛋白样品各10-15L（约2-10 g蛋白），若样品较稀，加样体积可达100 L，但注意样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量加样器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，注意针头不要碰破凹槽胶面，轻轻加入样品。由于样品溶解液中含有比重较