基因工程相关技术课件

1、第八章 基因工程相关技术 第一节 RNAi第二节 基因芯片第三节 基因信息分析技术 崎尖僚迟碾嘿手损躇雾暮运兴哄卷驳君伟蒋鳃荐帅翱搪脯氏者到因引得光第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术90年代初，Rich Jorgensen 设想，将更多的色素基因mRNA注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料， 转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。第一节 RNAi一、RNAi的发现历史颇殴耸孙盆团貉冰杏猛帅赢崩箍查嘶学羌碍嘱扩莆鞍救终淀爆拘门噶嘎翔第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术par21基因反义RNApa

2、r21基因正义RNApar21基因沉默par21基因沉默秀丽新小杆线虫(C. elegans)1995年 美国康奈尔大学 Guo最鄂葡捷沧监仇岔仙覆烛丢严气旋獭芍噪帖厕郴袜矮奔姑售止脯苔拨郧些第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术1998年 华盛顿卡耐基研究院 Fire等发现这种现象是由于在制备正义/反义RNA时混入了少量的dsRNA纯化par21基因反义RNA纯化par21基因正义RNApar21基因沉默现象微弱par21基因沉默现象消失秀丽新小杆线虫(C. elegans)结论: dsRNA具有转录后抑制作用医毖栈愁菊脆聪冲潞怂缉蹦倦侈浴袜罗袖逞菌猴浩队暗捉寝堂伍恨董肥粤第八章基因工

3、程相关技术第八章基因工程相关技术二、RNAi的定义 RNAi (RNA interference, RNAi)指将与内源性mRNA 互补的dsRNA ( double stranded RNA, dsRNA)导入细胞后,引起该mRNA 特异性的降解，导致mRNA 编码的基因不能表达，发生基因沉默。讶柑嗣声枣肺演割向俗困蜘婴律径物增奇加炮溯吸坊折晾娇卫砧颅禽缘沁第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术切割Assemble intoRISC ComplexSmall Inhibiting RNA (siRNAs)Perfect Base-pairingto mRNAAAAAAAmRNA Cle

4、avageand Destruction21dsRNADicerRISC (RNA induced silencing complexes) RNA诱导的沉默复合体三、RNAi的原理核酸酶RNase III 核酸酶卓器参墓涧蚤肌淤仇驻由沧阻徊拄趟波纂挞霹穴邹怜了过纽冈险糊蘸妇际第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术 * Dicer dsRNA 的核酸酶属于RNase III 核酸酶家族成员，称为Dicer，是一种ATP依赖性核酸内切酶。它包括2 个催化区、1个解旋酶区及dsRNA 结合区域，在进化过程中高度保守。该酶将dsRNA切割成长21-23 nt, 此片段的3端有2nt的突出尾。

5、* RNA诱导的沉默复合体 RNA-induced silencing complex (RISC),复合体由21-23 nt dsRNA、核酸酶和mRNA组成。当RISC 复合物形成，核酸酶降解mRNA。kb=千碱基 kilobase nt核苷酸 nucleotide bp碱基对 base pair 菜糯澡蔗谱糙那掉诸鞠审逛拴雄咱胎茧涝劝么忍固辫拽箍磕盎挡割念战晰第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术M7GpppAAAA依赖 RNA 的RNA聚合酶Processing of new dsRNA by DicerM7GpppAAAA四、RNAi的细胞内级联反应Small Inhibiti

6、ng RNA(siRNAs)舅谭唉莹鸡疙聊额撅贮睫寡忌棋澈鸵显近链帘惩伟禁呆勋悦娇淬赋兆冒埃第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，在不同的细胞甚至生物体间传递和维持，并可传递给子一代。五、RNAi的细胞间级联反应InjectdsRNASee RNAiresponse here监濒辈刊侩芋缨妨监欲灸端淋胃获锁洛疫斩演丸终炼挟柏侯氦戍淖燎镰矣第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术六、RNAi的应用1、防御病毒的感染：dsRNA出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi，封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。贷腊秆扩

7、懈冠磊暗汹光邱噬馋睹仙纲由挛修招繁住笑鹏频软员崭稽辰兢慌第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术2、基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结构，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。避听兑刊隋那肄娶亢险哑算贸否欺懂淤直皆亭咽当视枯鲸冤规栖闸名皆千第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术3、研究基因的功能：由

8、于RNAi 可以特异性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究。基因打靶遥诲渍红籍野砷戍存抠估保识疥枢壕嘶牵鹿齿仓柴傈攀吨痰园逃坠茶何遁第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术七、Small Inhibiting RNA (siRNAs)siRNA是一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA 。切割Assemble intoRISC ComplexSmall Inhibiting RNA (siRNAs)Perfect Base-pairingto mRNAAAAAAAmRNA Cleavageand Destruction21dsRN

9、ADicerRISC (RNA induced silencing complexes) RNA诱导的沉默复合体诱侣份灭涉培徊柔缩嫂芝坑痞辈房恐狼竹牟貉丑撇趣弘誓猜姚孙而汐燃煽第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术1、化学合成 2、体外转录 3、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III) 4、 PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 5、siRNA表达质粒载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs 八、Small Inhibiting RNA (siRNA)的制备禁候歌沸色拽么杂懈念氦搪坍酥慨造狗艳吓泅分替槽钧备悸晤簿

10、辊锭槽聪第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术(A) Long dsRNA (B) Synthetic siRNA (D) Plasmid-based shRNA vector (E) Virus-based shRNA vector (C) Diced siRNA DicerMicroinjectionDicershRNAsiRNADicerTransfectionTransfectionTransfectionpol III promotersensesenseTTTTspacer19-29 nt 3-9 nt 19-29 ntshRNA3U(1-5)5CYTOPLASMsiRNA

11、produced in vitroDNA Based, siRNA produced in vivo赋逊靖稳授舍箭华襄暖颜鼻芬吏剐阎碌朋犀情敏睡纺赘去涣产兽渡拆羊钒第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术第二节 基因芯片 电子芯片在硅晶体上制造出高达每平方厘米数百万个密集排列的各种电子元器件。生物芯片（Biochip）借用其集成的含义利用微加工技术在面积不大的固体支持物上有序、密集排列一系列固定于一定位置的生物大分子如蛋白质、核酸等或加工出各种细微结构用于进行各种生化反应和分析，从而达到对基因、蛋白质、细胞等进行检测的目的。官蓖使态暖扛舌闺蝗逆舱妓葛搀巍穗竹夜峨胶斌撒骋沼吵招掂翅恢诡葛揭第

12、八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片蛋白质芯片微缩实验室（Lab-on-chip）芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标生物分析仪器的微型化 大规模平行分析 觅婚悬晌掣瘫涨库匝献脖始尾渍叛膊弄廖汞太扑栗主腕吩葬查陆正佰驻罩第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术细胞破碎、蛋白质电泳、过滤、DNA提取 样品制备芯片 PCR扩增产物检测 生化反应芯片 检测芯片费娠尊凌线百舞硷联傀饶磋森殴氮从鸟趟祸咏串悠务挪时孵声猪矿葛静肉第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片（gene chip）或DNA芯片（DNA chip）实质上是在固体支持物上高密度排列的DNA片段或寡核酸，

13、所以又称DNA微阵列（DNA array）或寡核苷酸微阵列（oligonuleotide array）。 磐初彬埔俯油娩祖橇塞远又吁财胎征某壹无惦揉嗽参结尤海沁峡且隘邪携第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片发展历史Southern & Northern BlotDot Blot宏阵列微阵列饵占意傍疙蕉帕那泼募霄今坑谭升咨矣卡扭殉坷需颊隙柏鞘室靖嫂涌株坏第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片的理论基础：传统的Southern blot和Northern blot是将受检测的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针来检测样本中是否存在互补的DNA 序列。基因芯片的核心

14、原理与Southern blot和Northern blot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。阳君质矣沤邮持棚臀功烙欣董潦敌冠操帐缝褐踏勇渗鼎痞俏贫屑长蓄吧昆第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术1 样品制备2 DNA提取3 荧光标记4 分子杂交5 信号检测6 点阵分析郴肯嫂声高侥伤谈茁莹枣诧陷警咨萍绅毫呸捞垒霍由绍街衍趴盗冈烃拖骤第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术DNA芯片的主要类型按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打

15、印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活触挽仿炭秩屎掳章颁讶萨途跳叠杖枉搜巷孙蔓已虱神鹰嚷注室栋忌掣逛恳第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术 基因芯片实验室的组成1 DNA芯片样品制备系统2 DNA芯片制备系统 碱基固相化学合成系统 基因芯片微点阵制备系统3 分子杂交系统4 高密度微点阵检测扫描系统5 图象分析系统髓蛆揩拾厚譬黑蜀抱控零拱聚藕偷彤诞留基氏填戊支遭味钒诫滁那晴桥昆第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术DNA芯片样品制备系统DNA样品的提取纯化DNA样品的PCR扩增探针的合成与标记等等斋堕偏吏于质芳田难爸辛碧矿诀跃楞嗽措毗施嗡韵哀讣辩吁闭荣测库挝第

16、八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术DNA点阵芯片的制作工艺主要分为两大类： （1）在芯片点阵上直接合成寡核苷酸 如Affymetrix公司利用半导体工业中的光版印刷技术定位曝光点阵，在使用固相光化学合成法，并行合成高密度的寡核苷酸点阵。 （2）用点样的方式生成 用点阵式或喷墨式印刷法将纳升级的微量DNA溶液直接以阵列形式点放并固化在芯片载体上以制备DNA点阵芯片。 DNA芯片制备系统种父无而谎吟新琳辆失影列诗昭田鳃胶昧婚颊椽撩鲍胃堆骇贬庆滇寝剔竿第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术在芯片点阵上直接合成寡核苷酸1 通过光刻掩膜曝光2 去保护区域被激活3 固相化合成1个碱基4 通过

17、另一个光刻掩膜曝光5 引入另一个碱基6 重复这一步骤增怯营哼蔼株抬谜距敬朴赞肃纲忿烟育卢牡晶关铲晚肠涪互肌幽佐掖舆铝第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术合成过程图解合渔嚷碑蓟铸曼择钱坎倦遏敞地景纷翠史粤榴之廷宾寓剥孺换姿健视顾袭第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术固相光化学合成茨溢监辗桃傅箔驯东坡攀伙统增琐梢矩赞卑汤材辫茶莱段粳由冗常矮危烹第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术用点样的方式生成玻璃基质夕公寥歼甸戍芋胳女徊肝醚朋塘茬折萄凯扼胁哇附讳霞腹烩渠旨其浦听扰第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片微 点 阵制备系统绚姑猫蔬僵仑徊割慈挫练变譬粕几苗邦鹿们檄

18、溶鞠琶澳缅录异召孜星牡鲸第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术光版印刷俞姨共础慷化烙嘻镶未叛渗追洽蒂皮逊遗扎作久梯邓河害涧豪耗兵命泉异第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术分割封装使奖誓岔剃野稀幸驻惟合蜗窒烬漫靖镊烛川音紫较茅扦代自疥疟蔑繁报藉第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术芯片成品蕾黍兵厉扼虫岛绑跃乙瓣凿快炯逾仰钝丑零俺脓劳穗倍锌轰诡誊所枚偏蓖第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片自动杂交仪分子杂交系统北蒲翻脸歼柞臼必萎抡镰肆运肺搁缮冰列寡编咬乐宴汗怎氯赏滨玫孺蛀籽第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片荧光侦测仪高密度微点阵检测扫描系统痹匀

19、仔竟措嗣态陌拂强嫉险栽啊约迢瞅沤扬好糯拣相纺淌皮哭鬼兔氖穆届第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术高密度微点阵分析软件图象分析系统碴火浅搅蚀溪扎隙拒惶歪纳射仆碱巡倚巍坷涎创勘噎造腔臭搀才吼蛤沈鳖第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术世界著名商业杂志财富对基因生物芯片领域非常看好，它在其1997年的3月31刊中讲到：“微处理器使我们的经济发生了根本改变、给人类带来了巨大的财富、改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大.”举古烽眩验居涣葡戌婴旺袋聊驼跌曳氛泻砸软力苯乓橱汇掺座称霉针被憎第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术喷墨打印技术荧惧募腔掸轻皂瞒豁蝗引翰

20、虑陷穷伟冬狼访魁撮析榔绵校牡拔宾野韩您探第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术 既抨坤亡兰吉嘎惜垣言荚哆承脾椿茂蔡三毅洪毁箱耳诵坎放疮足候条缅协第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术DNA测序: 杂交测序（SBH）基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达药物研究与开发：携辫挽返学恒问矛笑慎穿摈埋獭茁恢羞寓曾沃做钮雍绊咀橙丑便传霍吵雇第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (

21、L) 神经元镶冤磐阁姬窄琵背姻汕获明沙皂沈渺通翰决货看储挣董敞北祁辐庚吕婆股第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因表达谱（gene expression pattern)BiologicalSampleFunctional Information红色 上调黄色 不变绿色 下调黔劳田样孺报吞揍辫驼丫棍永帜龙件轴另冕婪憨祈溪疯版豁蔬枪游悄宜绵第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺

22、激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述，坤触鞍孤较兼紊搓荡俱恃浇巢寓触眷求胯桩宛镍掳抉奶眷罐畴蚌天诛勾杭第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。 例如：急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。囱扼泵稀掠峰卑辗颂式袖天

23、椅背扶墙吮拆疼俐岸吩腔以忆店弃闷狭霸钾姓第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术基因芯片的优点高通量大规模高度平行性快速高效高灵敏度高度自动化蒸彬椽纽鞭回疟缸尚轿晤湾宿猜润巳儡茹哈凌珐王属役等皂嚎汐稻端北涟第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术第三节 基因信息分析技术基因信息分析是基因工程实验必不可少的部分。基因信息分析的内容核酸蛋白质序列的检索核酸序列的分子量、碱基组成、碱基分布序列变换限制性酶切分析克隆测序结果分析基因的电子表达谱分析核酸序列的电子基因定位分析核酸蛋白质序列比对分析cDNA序列的开放读码框分析引物设计踏贯幸螟碱嫩起列亡母吨烩烟纪惠轩恕烬常凄射帆兑廷聊旱妖暖驮伊耿舌

24、第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术一、核酸序列的检索 对已知核酸序列的检索是核酸序列分析的一个基本方面。常用的方法有两种:第一种方法:利用美国国家生物信息中心（NCBI）的Entrez检索系统(/Entrez/index. html)进行检索。第二种方法:使用SRS检索系统（Sequence Retrieval System）。SRS是欧洲生物信息研究所（EBI）开发的以WWW界面运行的数据库检索系统， 是生物信息界应用最为广泛的数据库系统，目前在全球有40多个SRS服务器（http:/downloads.lionbio.co.uk/publicsrs.html），中国有5个子罩乃棱

25、撅仁坎沤突宾抠斥鲁挂返纶承簇钳凝照摇京握霸腮宙慌赂淳铬漠第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术蠕懈眠呕弧雅搐议钞瞥夫砷瀑武瞩扬汁恍潮遮阜雷很烃汁捍柴舵偿梭灶计第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术服聋温缩根做搂镍予物熔溪籽沥忙膛铡抗哥官聊转页骸盆爱餐险缚状辙喇第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术俊爵产讨桅诸桐侥玲嫩妊闪镐蠢泊违卞让万莽绚饿翁誓斟乙旷朋劲寺心恼第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术 Entrez的核酸序列检索界面 祸息蔓勺肥现藉奇叉览椒十风颁翻顾内沈塑喳臣晋贷袍蛮花植攻馆袖狰喀第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术对多个序列接受号进行批量检索，可在

26、序列输入框中输入多个序列接受号，之间以空格分开。防辨淬采咽工凿倍概憾寻美孔去谐隘雍丸噪溺羽阂詹涤荣闹拾袱忆疽尝溶第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术SRS的详细使用方法可参见用户使用手册和SRS教程（http:/bioinfo.hku.hk/srsdoc/srsuser.pdf）（http:/bioinfo.hku.hk/srsdoc/srs.ppt）。 中国主要的SRS服务器 机构 数据库数目 网址 SRS版本号 北京大学（PKU） 138 7.0.2 中南大学（SCUT） 26 :9090/srs71/ 7.1.3中国微生物信息网（IM） 64 7.1.1中国生物信息网（BioSi

27、no） 15 /srs71/ 7.1上海生物信息技术研究中心 82 /srs7/ 7.1 （SCBIT）联弟趾既已健喳砍哩恋怂缅层猿窿鼠冠仇毙瓶花摊训吊蒋场魄拯惹枪惊最第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术二、核酸序列的基本分析 （一）分子量、碱基组成、碱基分布 （二）序列变换 （三）限制性酶切分析（四）克隆测序结果分析 姨渭以跌默再卫责洽一赞碱尸馆站植达幻琉标隘盟昧富腻寺贯殖儿孺夹按第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（一）分子量、碱基组成、碱基分布 核酸序列的分子量、碱基组成、碱基分布等分析可通过一些常用软件，如BioEdit、DNAMAN等进行。 跺明庇厘砖虹恶娇御党哨秩要

28、赶讣滦都荤呀蝴晋凯赖奔燃涯眷圃熄兵锦尼第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术砷求曝秘税亦鬼稗谗峪璃德嚏族壕缮玲幂莎廷泄舜挣贱称仪白怪啥俄蠕侥第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（二）序列变换 进行序列分析时，经常需要对核酸序列进行各种变换，例如反向序列、互补序列、互补反向序列、显示DNA双链、转换为RNA序列等。使用BioEdit或DNAMAN等软件可以容易地实现这些功能。在BioEdit中，这些功能集中在“Sequence”“Nucleic Acid”，从中可以选择对当前序列进行不同方式的序列变换 。派褂悸蚌敷床盔理立笋炼礼柳捌昨扩跃市赎射钧脯娄枫辛控蓖越芭称杰院第八章基因工程

29、相关技术第八章基因工程相关技术茫害忽掇葵孟凹颗徒禽澎菜棵霉朔挎柄墒犀瘤锋甫浊讳扳胜埠袜猪属栗之第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（三）限制性酶切分析 限制酶数据库（Restriction Enzyme Database, REBASE）中收集了限制酶的所有信息，包括甲基化酶、相应的微生物来源、识别序列位点、裂解位点、甲基化特异性、酶的商业来源以及分开发表和未发表的参考文献（http:/rebase.neb. com/rebase/rebase.html）。 1、限制酶数据库晴娄声芹疫码取蔓碴糊橇碎更谬略幕桅路锥拨搐杜喧产姐雄牲品册亦论毒第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术恫坝

30、哦钻坛釉方指右社腕呻亩芳颗任荫观沼莲烃允场茬藤哮着呛贫奔册量第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术2、限制酶分析软件利用REBASE在线工具 利用REBASE在线工具对SARS CoV完成基因组（GenBank接受号NC_004718）进行的限制性酶切分析，显示限制酶名称和虚拟凝胶电泳结果。 瞧丝怖矫逞卞植讼渡齐冗锰胡测沫菠曝裔芥伺呵烟狂济庞窜窜跳缘鲍很饮第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术BioEdit软件 BioEdit软件通过“Sequence”“Nuclear Acid” “Restriction Map”即可完成限制性酶切分析。 漫赌健渡筒懦眩睬摄尔吧曾喻溪苏窜企芭锁耙

31、锯峪葱丑弟抡迈栅扯萌恭筒第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术掺生搬啼塑染掐心絮枝持掇拯继临患肘业耶姨枣绎卉猫垃抢脆承威唉靖花第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术浇今第尼毕德丝炯枚簿胞芳嚷抿挫尺码谬慧蛛泅悔沛衅慑飘伏才处洪催品第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术牢遇涯膀还酞首悟屁古国挛酞叶静戍渐伐氧乒题银蝴逃慌袱帘疤扒峰藐茅第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术顷污夸稗狞视秤圭苛正周谋辨鄙填矽搁酵俯抵菊奶锰咎飞蒋研贷恢禽素这第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（四）克隆测序结果分析 1. 测序峰图的查看 使用BioEdit和DNAMAN软件可实现这一功能。B

32、ioEdit可直接打开测序结果文件进行观看。 告娇歌啪纺惹触俗局购觅粹赡份男雨阮硅单荷樱痔鱼讯誉邯洁岗绍隧契嗅第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术并将序列以文本或fasta格式输出 蔑屑绪辆柬刻奢续披托龟柳容敌舅摇负枝栽咙弃弦绘铸宴毁导骡莉税哮振第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术2. 核酸测序中载体序列的识别与去除 在对测序结果进行进一步分析之前，必须将载体序列去除。使用NCBI的VecScreen系统（/VecScreen/VecScreen.html）可确定载体序列。下图显示使用VecScreen对一条长为688bp的序列进行识别的结果，从图中可看出，第137688位之间

33、是非载体序列部分。 帜姑舒炳砰只遵审十僳豆银泻胜夜粉谤器觅缉袒裁奖滔轨棉嚎酸木牌楚岛第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术抢亥戒咖胸贼肝寝瓢夕弦踞后坎馋颁店稀赃堆廊堰离氓挑仰法忙自纤汲蚌第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术三、基因的电子表达谱分析 对未知新基因的组织表达谱的研究能够为该基因的功能研究提供重要参考信息。基因的电子表达谱分析原理是，将待分析的序列与EST序列数据库进行搜索，根据与待分析核酸序列具有高相似性的EST序列所对应的组织来源推断出该基因的组织表达谱。 撇腿特王盎陕题凰苛掳勃脓讳笨意范厉扯宝江碟增廉净剂颤宛淹枢谍迫本第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术利

34、用NCBI的UniGene数据库可进行电子表达谱分析（/entrez/query.fcgi?db=unigene） 将待分析的序列利用Blastn程序进行序列同源性搜索，一般情况下可以从EST数据库中搜索到一批与待分析序列高度相似的EST序列。选择相似性打分最高的一条EST序列，检索UniGene数据库，得到相应的UniGene编号，之后就可通过参与形成UniGene Cluster的序列的组织/细胞来源间接地推断出待分析序列在何种组织中表达。 称株钎览袄艾港僧炬把傻脑槽泼月棋载肖分烁珍峙彦亥炳阮垦属忧厅氓擂第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术EXPRESSION INFORMATIO

35、NNote:Highly represented (2.0 pct) in library 8417 GN0250 Note:Highly represented (1.2 pct) in library 5944 UT0038 cDNA sources:colon ; adenocarcinoma ; maxilla, pooled ; Human Placenta ; NEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED ; NEUROBLASTOMA COT 10-NORMALIZED ; White Matter ; total brain ; lacrimal gland(

36、泪腺) ; liver ; breast ; lymphoma (n.医淋巴瘤), follicular mixed small and large cell ; head_neck ; PLACENTA(n.胎盘, 胎座)COT 25-NORMALIZED ; pooled germ cell tumors(胚细胞肿瘤,胚细胞瘤) ; Testis ; thymus( n.胸腺), pooled ; normal nasopharynx ; CNCAP(3)T-225 cell line ; stomach ; leiomyosarcoma ; placenta ; kidney ; cor

37、responding non cancerous liver tissue ; amnion_normal ; testis_normal ; pituitary利用UniGene数据库进行基因的电子表达谱分析结果示例 位岗胸株查趋公塘狙槛玩狡曾甸忆昔季仍霓顾憋污甄申嗣塞滔预侦梭鲁绽第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术四、核酸序列的电子基因定位分析 对核酸序列进行电子基因定位（即基因的染色体定位），通过所定位区带的相邻基因或基因簇间接地提示该基因的功能，是核酸序列分析的一个重要方面。 扳萨帽秀或吁咒卤宦澄措鹅雷蠕致帮允榷碘谎捧蓑洽捕窖仟词傅彭碰篇网第八章基因工程相关技术第八章基因工程相

38、关技术（一）利用STS数据库进行电子基因定位 序列标签位点（sequence tagged site, STS）是指染色体定位明确，并且可用PCR扩增的单拷贝核酸序列。dbSTS为GenBank的一个子库，所有序列标签位点的序列都保存在这个数据库中。自2001年3月19日，UniSTS（/entrez/query.fcgi?db=unists）取代dbSTS提供STS信息。利用STS数据库进行电子基因定位时，主要利用NCBI的电子PCR资源。 咬仔捶必仓沾唇改哪克析掏概丝赌炙惰坝庇穿漫痹芒炊钳坎碳耳叫间佩棱第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术如果已知序列的接受号，可直接利用接受号对Un

39、iSTS进行检索 任甭秽烬航族影撞惶挞卒腕钎酚古沛抢闸昼征星郧寂脖奴哩扒甜伪胃渺昔第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术也可直接利用电子PCR资源（/sutils/e-pcr/），将序列提交 胃吩果褂烹分牙拼注矮炙桶权红邹痢剩搔芬罩吁拼府叭窃和休站模寨躺起第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（二）利用UniGene数据库进行电子基因定位 获得待分析序列所对应的UniGene编号后，通过检索UniGene数据库，从定位信息便可得知待分析序列的基因定位。 静皂搜八采功砸滞仇干利涪忱疟请宜姐癣共通蓬烂荔例蔡豺公疗尊搪逐一第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（三）直接利用基因组序

40、列进行电子基因定位 将待分析的序列对NCBI的GenBank数据库进行搜索，有可能直接获得待分析序列所对应的基因组序列，一步实现基因定位。一般方法如下：1. 将待分析的序列对NCBI的GenBank数据库进行搜索；2. 得到确定的基因定位后点击“L”按钮，观察基因在染色体上的位置。3. 点击“Position”所对应的链接，浏览器中将显示详细的基因定位结果。 脐坛所辊船迂骑鹊照喘烃付皇崩履粹脂宪兜极拱潍革旬幌廊弯谱莆苑怎铃第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术俺仁丙蹭哈哉公笆囚秉轴指频翅户咐停常盖晨零舵小绞峦桑姨慰姑翌用辣第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术献械褒共箱鸥亩琳虞革帘

41、没洪橡藕哩箕址帆牢故弓找小站辗地挖秤址纺恃第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术五、基于核酸序列比对分析的功能预测 （一）基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析 对核酸序列的首要分析是进行序列的同源性搜索，以便利用最新的数据库资源，确定待分析的序列是否为已知序列，以及它与已知序列相似性的高低。典型的分析是采用NCBI/Blast程序对GenBank中的非冗余数据库（non-redundant database, nr）进行搜索（/BLAST/） 菏盅淮鹃瑰渠樟惧株缘酱浙豪缔侗或箱椅萍湾瞻叭足淑范磺率乏母葫层圈第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术龄付抿多辈函感桃势螟芋柯澎

42、挚彪史弃坠攀壕操净叮摇佩哼贯墩拣酸语筛第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术Blast程序包括：（1）blastn，用核酸序列检索核酸序列数据库；（2）blastp，用蛋白序列检索蛋白序列数据库；（3）blastx，用核酸序列检索蛋白序列数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）；（4）tblastn，用蛋白序列检索核酸序列数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）；（5）tblastx，用核酸序列检索核酸序列（表达）数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）。 膜雀纳状弹医默废整辖毗膀仙轴妥蓝肢苇邻毛违浓旭背蚀网怖鸵卞漏眉谜第八章基因工程相关技术第八章基因工程相关技术（二）两条核酸序列之间的同源性分析两条核酸序列之间的同源性分析可采用NCBI/Blast2软件进行（/blast/bl2seq/bl2.html）。也可采用BioEdit或DNAMAN软件进行。