液相色谱法课件

1、第八章 液相色谱分析 第一节 概述第二节 柱色谱法第三节 薄层色谱法第四节 纸色谱法第1页，共67页。第2页，共67页。色谱法(chromatography)概述历史：1903年，俄国植物学家Mikhail Tswett 最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素 chlorophylls & xanthophylls)加于柱顶端，然后以石油醚淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱 (希腊语 “chroma”=color; “graphein”=write) 。第3页，共67页。概述 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相

2、（固体或液体）称为固定相 ；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。第4页，共67页。色谱法的分类按两相状态分类 固定相 流动相 1. 气体为流动相的色谱称气相色谱 （gas chromatography , GC）固体液体液体气体气相色谱气-固色谱（GSC）气-液色谱（GLC）第5页，共67页。第6页，共67页。色

3、谱法的分类2. 液体为流动相的色谱称液相色谱 （liqud chromatography, LC） 液相色谱液-固色谱（LSC）液-液色谱（LLC）第7页，共67页。色谱法的分类按分离机理分类 1. 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 2. 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 3. 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。第8页，共67页。色谱法的分类 4. 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或分子排阻色谱法。 最近，又有一种新

4、分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。第9页，共67页。色谱法的分类吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）:不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。第10页，共67页。色谱法的分类 按操作形式分类 1. 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。 2. 固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。第11页，共67页。色谱法基本原理分配系数K 在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间

5、分配达平衡时的浓度(或溶解度)之比值，即第12页，共67页。色谱法基本原理色谱机理不同，分配系数的含义不同： 吸附色谱 K为吸附平衡常数 分配色谱 K为分配系数 离子交换色谱 K为交换系数 分子排阻色谱 K为渗透系数第13页，共67页。色谱法基本原理色谱分离过程的特点: 1. 差速迁移; 2. 谱带扩展.色谱法的定义: 色谱法是利用混合物各组分在两相(固定相和流动相) 中分布的差异，使固定相对各组分的保留作用不同产生差速迁移而得到分离的一种物理化学分离分析方法。第14页，共67页。色谱法基本原理分配系数与保留行为的关系 溶质在色谱柱中被保留的程度常用保留比（retention ratio）R

6、表示。 R 1第15页，共67页。第二节 柱色谱法一、液固吸附柱色谱法二、液液分配柱色谱法三、离子交换柱色谱法四、凝胶柱色谱法五、柱色谱法的应用第16页，共67页。第二节 柱色谱法 将固定相均匀填在金属或玻璃制成的管中做成层析柱，并以此进行分离的方法叫柱色谱法。根据作用原理，可分为：吸附柱色谱法分配柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法第17页，共67页。第二节 柱色谱法一、液固吸附色谱法liquid-solid adsorption chromatography 固定相固体吸附剂 流动相液体原理： 利用吸附剂对不同组分的吸附能力的差异而实行分离。第18页，共67页。第二节 柱色谱法吸附作用 固

7、体吸附剂是一些多孔性物质，表面上有许多吸附点或称吸附中心。吸附剂之所以具有吸附作用，主要靠吸附剂表面的吸附点位。硅胶吸附剂：第19页，共67页。第二节 柱色谱法吸附平衡 Xm+nYa Xa+nYm吸附平衡常数式中： X溶质分子；Y流动相分子 m流动相；n流动相分子系数；a吸附剂表面 组分的吸附系数Ka越大，越容易被吸附，保留时间越长，流出色谱柱就越慢。第20页，共67页。第二节 柱色谱法吸附剂极其选择对吸附剂的要求： 1. 具有较大的表面积与适宜的活性。 2. 与流动相极其样品中各组分不发生化学反应，在流动相中不溶解。 3. 吸附剂颗粒应有一定的细度，并且颗粒要均匀。第21页，共67页。第二节

8、 柱色谱法常用的吸附剂有： 氧化铝、硅胶、聚酰胺硅胶： 呈微酸性 适用于分离酸性和中性物质，如：有机酸、氨基酸、萜类、甾类等的分离。第22页，共67页。硅胶具有多孔性的硅氧交联结构硅胶骨架表面有许多硅醇基硅胶骨架表面的羟基与水结合形成水合硅醇基第二节 柱色谱法硅胶结构第23页，共67页。 加热500oC时，交联内部的结构水不可逆的失去，硅醇结构变为硅氧烷结构。硅胶结构第24页，共67页。第二节 柱色谱法氧化铝 碱性（pH = 9 10） 中性（pH 7.5） 酸性（pH = 5 4） 碱性氧化铝适用于分碱性和中性物质分离，如生物碱。中性氧化铝适用于分离生物碱、挥发油、萜类、甾类、酯类等。 酸性

9、氧化铝适用于分离酸性氧化物，如氨基酸、酸性色素等。第25页，共67页。第二节 柱色谱法氧化铝的分离机理第26页，共67页。第二节 柱色谱法流动相的选择应考虑以下三个方面： 1. 被分离物质的结构与性质 2. 吸附剂的性能 3. 流动相的极性选择的规律: 试样组分的极性大，应选用吸附活性较弱的吸附剂，极性较大的流动相；试样组分的极性较小，应选用吸附活性较强的吸附剂，极性较小的流动相；第27页，共67页。第二节 柱色谱法常见取代基的极性犹大到小的顺序是：烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 二甲胺 酯类 酮类 醛类 硫醇 胺类 酰胺 醇类 酚类 羧酸类第28页，共67页。第二节 柱色谱法常用流动相的极性由

10、强到弱的顺序为：石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 甲苯 乙醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 水第29页，共67页。第二节 柱色谱法二、液液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相液体 流动相液体原理： 利用混合物中不同的组分在两相中有着不同的分配系数（溶解度）而实行分离的。第30页，共67页。第二节 柱色谱法固定相 分配柱色谱法的固定相由担体和固定液组成。担体（载体）： 是一种惰性物质，不具吸附作用，只起负载固定液的作用。常用的担体有：多孔硅藻土、纤维素、硅胶等。第31页，共67页。第二节 柱色谱法流动相 分配色谱中的流动相与固定相

11、的极性应相差很大，才能互不相溶。常用的流动相： 石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷及苯或它们的混合物。第32页，共67页。第二节 柱色谱法三、离子交换色谱法 ion-exchange chromatography 固定相离子交换树脂 流动相水溶液分离对象： 离子型化合物原理： 利用各种离子对交树脂的竞争交换能力不同 而实行分离的。第33页，共67页。第二节 柱色谱法离子交换树脂的分类阳离子交换树脂阴离子交换树脂离子交换树脂第34页，共67页。第二节 柱色谱法阳离子交换树脂 在树脂骨架结构上引入的是酸性基团，如磺酸基SO3H，羧基COOH和酚羟基OH等。这些酸性基团上的H+可以和溶液中阳离子发生交

12、换反应，故有阳离子交换树脂之称。阳离子交换反应为： nRSO3H+Mn+ (RSO3)nM+nH+第35页，共67页。第二节 柱色谱法阴离子交换树脂 在树脂骨架结构上引入的是碱性基团，如季胺基N(CH3)3+，伯胺基NH2和仲胺基NHCH3等。则这些碱性基团上的OH-可以和溶液中阴离子发生交换反应，故有阴离子交换树脂之称。阴离子交换反应为：RN(CH3)3OH+Cl RN(CH3)3Cl+OH第36页，共67页。第二节 柱色谱法离子交换平衡离子交换反应用下面通式表示:当反应达到平衡时,可用交换平衡常数 表示:A+r、B+r分别表示树脂中A+、B+离子浓度A+、B+分别表示水溶液中A+、B+离子

13、浓度第37页，共67页。第二节 柱色谱法选择系数与分配系数的关系可表示如下： KB/A大；KB大； A+先出 KB/A小；KA大； B+先出第38页，共67页。第二节 柱色谱法四、凝胶柱色谱法size- exclusion chromatography 固定相交换树脂 流动相水溶液分离对象： 蛋白质及其它大分子化合物原理： 按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。第39页，共67页。亲和色谱（AC）Affinity chromatograph（了解） 原理：利用生物大分子和固

14、定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第40页，共67页。第二节 柱色谱法柱色谱法的应用 1. 分离纯制 2. 盐类的测定第41页，共67页。第三节 薄层色谱法基本原理吸附剂的选择展开剂的选择操作的方法定性和定量分析第42页，共67页。第三节 薄层色谱法 将固定相均匀地铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属薄片表面上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法。根据作用原理，可分为：吸附柱色谱法分配

15、柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法第43页，共67页。第三节 薄层色谱法薄层色谱法的特点： 1. 展开时间短； 2. 分离能力强； 3. 灵敏度高； 4. 显色方便； 5. 设备简单，操作方便。第44页，共67页。第三节 薄层色谱法薄层色谱法的特点 设备简单，操作方便。只须一块玻璃板和一个层析缸。分析原理与经典柱上色谱相同、但是在敞开的薄层上可以检查混合物的成分是否分开可观察。快速，展开的时间短。比纸上色谱快速。一般纸上色谱需要几小时至几十小时薄层色谱一般只需十几分钟或几十分钟。使用无机吸附剂，薄层色谱可以采用腐蚀性的显色剂，如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸。对于特别难以检出的化合物，可以喷以浓硫酸

16、，然后小心加热，使有机物碳化，显棕斑点，纸纸上色谱则无法检出。广泛地选用各种固定相，比纸上色谱有显著的灵活性。广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。第45页，共67页。第三节 薄层色谱法纸上色谱法斑点的扩散作用严重，降低了单位面积小样品的浓度，降低检出灵敏度。薄层色谱法扩散作用较少，斑点比较密集，检以灵敏度较高。薄层色谱法适于分析小量样品(一般儿到几十微克，甚至小到上述的l-11)，也适于大量样品的分离（可以分离出几毫克甚至几十毫克组分）。可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分

17、析热不稳定，难挥发的样品。 第46页，共67页。第三节 薄层色谱法薄层色谱法分离原理 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。第47页，共67页。BAabcRf值的测量示意图比移值与相对比移值比移值 试样展开后各组分斑点在薄板上的位置可用比移值Rf来表示。第三节 薄层色谱法第48页，共67页。第三节 薄层色谱法Rf 取值范围: 0 1Rf 可用范围: 0.2 0.8Rf 最佳范围: 0.3 0.5第49页，共67页。第三节 薄

18、层色谱法相对比移值第50页，共67页。第三节 薄层色谱法吸附剂的选择硅胶：微酸性极性固定相，常用吸附剂，其活度与含水量有关，适用于酸性、中性物质分离。氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离，根据制备时的pH不同，又分为碱性、中性和酸性。聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离 (分离易生成氢键的极性化合物)。纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质 (极性有机化合物及金属阳离子、阴离子分离)。第51页，共67页。第三节 薄层色谱法展开剂的选择 在吸附薄层色谱中，选择展开剂的一般原则和吸附柱色谱中选则流动相的原则相似。即极性大的组分需用极性大展开剂，极性小的

19、组分需用极性小展开剂。第52页，共67页。第三节 薄层色谱法吸附剂和展开剂的一般选择原则是：非极性组分的分离选用活性强的吸附剂，用非极性展开剂；极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，用极性展开剂。实际工作中要经过多次实验来确定。第53页，共67页。第三节 薄层色谱法薄层色谱法中常用的溶剂，按由弱到强的极性顺序排列是：石油醚 环己烷 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烷 苯 甲苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 吡啶 酸 水第54页，共67页。第三节 薄层色谱法操作方法薄层色谱法的一般操作程序: 1. 制板 2. 点样 定性分析用玻璃毛细管点样 定量用微量注射器 3. 展开 4.

20、 显色第55页，共67页。第三节 薄层色谱法展开方式上行法：展开速度慢、容易达到平衡，分离效果好下行法：展开速度快、适用于易分离的组分分离双向法：使用两种展开剂、90度展开、适用于难分离的混合物的分离 第56页，共67页。第三节 薄层色谱法定性和定量的分析定性分析定量分析 1. 目视比较法 2. 斑点洗脱法 3. 薄层扫描法第57页，共67页。第四节 纸色谱法纸色谱分离法 1方法原理 原理：纸上色谱分离法是根据不同物质在固定相和流动相间的分配比不同而进行分离的。 固定相：滤纸利用纸上吸着的水分(一般的纸吸着约等于自身质量20的水分) 流动相：有机溶剂 操作：点样、展开、干燥、显色、测定（定性和定量） 第58页，共67页。第四节 纸色谱法. 应用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分离展开剂：正丁醇：冰醋酸：水4：1：2显色：茚三酮葡萄糖、麦芽糖和木糖混合糖类的分离展开剂：正丁醇：冰醋酸：水4：1：5显色：用硝酸银氨溶液喷洒，即出现Ag的褐色斑点。定性：由Rf值可判断是哪种糖；葡萄糖的Rf为0.16，麦芽糖的Rf为0.11木糖的Rf是0.2 第59页，共67页。第四节 纸色谱法第60页，共67页。习题 6. 在吸附色谱中，以硅胶为固定相，当用氯仿为固定相时，样品中某些组分保留时间太短，若改用氯仿-甲醇（1:1）时，