质谱发展历史基础知识课件

1、质谱发展历史-基础知识质谱发展历史-基础知识什么是质谱仪?质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化)主要组成部分:1.进样部分2.离子源3.质量过滤器(分析器)4.离子检测器离子源质量过滤/分析器检测器进样部分样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIon trapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器 第二章 质谱仪的组成+ + + + + + + + + + + + + + + + +第一节 进样部分要求： 大气压下的样品要进入高真空

2、的质谱仪，而不影响仪器的真空度。方式： 进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱） 第二节离子源A :EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.EI的优缺点 优点1.级的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构 缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子FBI快速原子/离子轰击离子源

3、Fast Atom/Ion Bombardment 使用高能量的氙原子Cs+离子或甘油-NH4+集团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化.基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.FBI优缺点 优点1、质量数可以做到7000Da。2、快速。3、软电离方式，碎片离子少。4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。缺点1、质量数高时灵敏度下降严重。2、灵敏度比MALDI,ESI低。3、碎片少，结构信息少

4、。4、基质多峰，干扰结果分析。5、样品必须能溶于基质。6、非极性物质难以离子化。 C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/IonizationMALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1、使用基质，但基质为固体。2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。常用基质1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物4、吡啶甲酸 PA5、

5、3羟基吡啶甲酸 3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析常用基质结构DHBSACCA MALDI的优缺点优点1、质量数可达300,000Da。2、attomole 至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对

6、各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes The sample should NOT contain anyAzide SDSBrij 35 Tris baseCHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100DMSO TweenDMF Zwi

7、ttergentGlycerol any other detergentPhosphate buffersSalts and buffers 100 mM The following components are ACCEPTABLEAcetic or formic acidAcetonitrile, ethanolGuanidine/HCl 4MHexafluoroisopropanol up to 40%MethanolSodium chloride 10 mMUrea 1M D: ESI离子源Electrospray Ionization4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带

8、电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷NANO-ESI喷雾照片ESI特点1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。电荷数和质量

9、数的计算已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nkm/z相对丰度mjmkESI优缺点优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测

10、多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。E: 其他离子化方式阳离子化: 以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。 尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这以过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。 阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+.阴离子化: 分子失去一个质子，带上正电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。 第三

11、章 质量分析器（过滤器）第一节：质量分析器的主要指标A、质量范围（/） 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。nD、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。不同分辨率谱图效果E：分子量的表述方式1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。 只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。2、化学平均分子量M 根据同位素质

12、量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。 表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰， m/z 8000时与最高峰质量趋于一至。第二节 质量分析器的种类A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率， DC： RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。 DC+RF四极杆质量分析器的 优点四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接1、能容忍相对低的真空度（约10 x10T

13、orr）2、m/z可达3000， ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。3、开销低廉。B、离子阱质量分析器 三维的四极杆，RF加在环形电极上。环形电极 离子阱质量分析器 三维的四极杆，RF加在环形电极上。C、飞行时间质量分析器 Time-of-Flight Analyzer 离子的E=UZ=mv 飞行时间t=t=constLvmz反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS)UrefTOF对真空度的要求非常高10TorrMALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOFD、傅立叶回旋共振质量分析器fourier Transform-Ion

14、Cyclotron Resonance质量精度最高，达0。001几种质量分析器的比较第三节：质量分析器的串联目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析 Collision-induced dissociation(CID)Ion source ion daughter ion granddaughter ion选择离子 MSCIDMS/MSCIDMS/MS/MS空间串联质谱仪A、串联四极杆（三级四极杆） triple-Quadrupole AnalyzerQ为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元几种检测方式1、MS方式： 所有离子通过QQQ到达检测器。2、MS/MS方式： Q作为分析器选择母离子(前

15、体离子），Q作为碰撞室产生子离子，子离子由Q分析。3、MS方式：三级四极杆的几种扫描模式1、子离子扫描模式：即MS/MS。2、前体离子扫描模式： Q依次将所有离子输入Q碰撞解离，Q设定一个特定子离子值，只检测此特定子离子， Q与Q联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。3、中性丢失扫描： Q扫描与Q有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。B、三级四极杆飞行时间质谱仪Quadrupole time of flightC、飞行时间飞行时间质谱仪Time-of-flight/time-of-flight时间串联

16、质谱仪A、离子阱质谱仪：B、傅立叶回旋共振质谱仪Fourier transform-ion cyclotron resonance 离子进入共振腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MS。几种串联质谱优缺点对比优点缺点三级四极杆质量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全。RTOF价廉前体离子选择困难子离子分辨率低。FTMS质量精度最高，子离子分辨率好，非常适合多级质谱低能量碰撞，需超导磁体，价高。离子阱相对价廉，质量精度高，分辨率好，适合多级质谱低能量碰撞QTOF质量精度高，分辨率好，前体离子选择性好，ESI、MALD

17、I均可接。需高真空，价高。第四章 检测器一、电子倍增检测器：真空度低，表面易污染，寿命一般12年。二、光电转换倍增器（闪烁计数器） 电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。三、HED(High-Energy Dynode Detector) 在离子倍增器前加一个加速静电场，离子加速 后产生更多的二级电子引发电子雪崩，灵敏度更高。四、FT-MSFT-MS本身就是一个检测器，因为离子诱导产生的可检测电流与m/z有关。第五章、质谱在生物学中的应用一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。二、串联质谱鉴定蛋白技术The nomencla

18、ture of the common peptide fragment ions developed by Roepstorff and Fohlman The proposed mechanism of formation of b and y-type ions 三、肽序列标签技术 通过测部分氨基酸序列，结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索，称为肽序列标签技术。四、O标记从头测序技术 蛋白酶解时，酶解液中H2 O和H2 O各占50， 酶解后肽段的羧基端上的羟基氧 O/ O丰度比1：1，使Y型离子系列的M+2/M同位素峰的丰度高于正常未标记 O的离子的同位素丰度比。1818

19、16181618五、磷酸化蛋白质的鉴定A：MA结合磷酸酶水解磷酸化蛋白MS蛋白酶水解MS磷酸酶脱HPO3MS通过比较几级质谱图，比较质量数少80Da或80倍数的肽段。B、串联质谱进行母离子、中性丢失 扫描，分析含HPO3的肽段产生的特征离子，直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。C、PRD-MALDI-MS用源后衰变技术寻找质量数少80Da或98Da的肽段来判断磷酸肽。D、用IMAC技术分离/富集磷酸肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金属亲和色谱。IMAC 对磷酸肽有高选择结合能力，富集后用高PH或磷酸盐洗脱后测质谱。E、磷酸化位点的确

20、定找到磷酸肽后，串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。F、磷酸化定量分析1、N稳定同位素标记法：N培养基1415N培养基142、同位素亲和标记法细胞池1细胞池2混合消除氘消除氢亲和纯化酶解MS磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段进行MS检测。六、糖基化蛋白的鉴定A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质谱图比较，可知糖链的平均质量。B、糖基化位点的确定先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再

21、用糖苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。C、用凝集素直接提取含糖肽段，再结合质谱技术分析凝集素对含糖肽段有专一亲和性七、质谱在蛋白质组学中的应用A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍B、同位素亲和标签技术ICAT专一与Cys共价结合优缺点 优点1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂（如SDS、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。3、只分析含Cys残基的肽段，降低分析复杂性。 缺点ICAT本身分子量较大（500Da左右）增加数据检索复杂性。无法分析不含Cys的蛋白。Why 2D LC/

22、MS?可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质适合膜蛋白重复性好容易自动化上样量大高灵敏度（溶液酶切）可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP）Then why SCX/RP/MS?SCX和RP的分离原理是互补的SCX按荷电情况，PR按疏水性流动相是兼容的pH3，ACN/water/saltSCX流动相中的盐可以在RP时有效去除Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的Separation powerPeak capacities2DE 500 - 10,000 protein spotsAffinity Chromato

23、graphy 2Ion exchange Chromatography 10protein levelGelfiltration 10Reversed Phase Chromatography50Ion Exchange Chromatography 25Reversed Phase Chromatography 100peptide level2DLC (IEX/RPC)2,500Linear IT MSn18,000 mph*measurements per hour(7) Sample Considerations for LC/MS 样品的要求The Analyte Must Have

24、 Ionizable GroupsAminesCarboxylic AcidsKetones, AldehydesFor Best Sensitivity, Work at a pH Where the Analyte is IonizedNeutral to basic pH (7-9) for acidsAcidic pH (3-4) for basesSample Considerations for LC/MSPositive Ion Mode Analyte = (M+H)+Negative Ion Mode Analyte = (M-H)Basic Compound Sensiti

25、ve in Positive Ion ModeAcidic Compound Sensitive in Negative Ion ModeMS/MSMSGelGel spotProteolyticpeptidesMixture of ProteinsDigestionProteolyticpeptidesDigestionLCProtein Identification WorkflowsPeak FindingPeak listSearch of a Sequence CollectionIdentified and ProteinsProtein CandidatesSignificanc

26、e TestingProtein Function?Sequence Similarity SearchRPCIEXRPC trapRPC trapon-line elution by salt plugs to trap columnIEXoff-line gradient elutionwith “classical”fraction collectionRPC2D LC的三种配置形式IEXRPCin-line MudPITon-line 2D-LC优点全自动样品体积可根据后续RPC调整在线脱盐、浓缩自由选择缓冲盐缺点SCX峰容量有限ACN浓度在IEX和RPC得一致两相分离都没能在最佳状态

27、下进行RPCIEXRPC trapRPC trapoff-line SCX with fraction collection优点两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量可自由选择缓冲体系样品体积可根据后续RPC调整速度快（只需一个SCX操作）SCX馏份可留待以后分析(ESI和MALDI均可）缺点自动化程度低IEXGradient elutionwith “classical”fraction collectionRPCThe secret behind sensitivityReducing column dimensions75 m I.D. columns and 200

28、nl/min are the standard todayscalecolumn I.D.column volumetypical flow rategain inm(100 mm length) ll/minsensitivityanalytical4.6001.7001.0001narrow2.1003502005micro1.000804021capillary30074237nano750.50.23.32275 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard todayData dependent MS/MS基本原则先做一次全扫描（ful

29、l MS)，记录个丰度最高的离子然后依次对这X个离子进行CID, 做MS/MS(full MS2)然后再做全扫描, 下一个data dependent MS/MS开始Dynamic exclusion某个离子在做了一定次数（比如2次）的MS/MS后，将在一定时间内（比如3min）不再作为侯选离子。碎片离子的命名 Residue name (A-Z) monoisotopic massaverage massA71.03711 71.0788B114.53493114.59625C103.00919103.1388D115.02694115.0886E129.04259129.1155F147.

30、06841147.1766G57.02146 57.0520H137.05891137.1412I113.08406113.1595J0.00.0K128.09496128.1742L113.08406113.1595M131.04049131.1925N114.04293114.1039O0.00.0P97.05276 97.1167Q128.05858128.1308R156.10111156.1876S87.0320387.0782T101.04768101.1051U150.95364150.034V99.06841 99.1326W186.07931186.2133X111.0111

31、.0Y163.06333163.1760Z128.55059128.62315氨基酸残基质量ESI-MS/MS vs MALDI-MS/MS why LTQ/LCQ type instrument so popular in proteomics?主要特点1 能做高通量、复杂体系的蛋白质鉴定，通量约为每小时鉴定100200个蛋白。2 动态范围宽，能在混有大量高丰度蛋白的体系中，鉴定出痕量的低丰度蛋白。3如数据库中检索不到结果，可自动进行de novo的测序。4集成ICAT或其它同位素标记的蛋白定量方法。5 能测定多种翻译后修饰（如：磷酸化、糖基化等）的个数和位点。6 能够测定寡核苷酸序列。7 能够解析蛋白的一些共价和非共价的相互作用。8能够表征药物、天然产物等的结构，推测其断裂机理，进行药物代谢研究。9对化合物进行精确定量分析。10灵敏度高达fmol级，分辨率高，可进行超高分辨扫描。Why nanospray 提高灵敏度Protocol for a Keratin-Free Environment1) Perform as much work as possible in a biological safety cabinet (BSC)or laminar flow hood 2) Assume that