质粒DNA测定-试验报告

1、南方国科大学生物化学实验报告姓 名:学 号:专业年级:组另I:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的.掌握PCRS因扩增的原理和操作方法.掌握碱裂解法提取质粒的方法.了解紫外吸收法检测DNA&度与纯度的原理、方法.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1. PCR（多聚酶链式反应）在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP

2、为原 料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制 DNA,使目的DNA按 2n方式呈指数形式扩增。PCFH次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95 C ,使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570C,一般低于模板Tm值的5c 左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温 72C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链2.质粒DNA的提取与制备(1)碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色

3、体 DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒 DNA复性并保存在溶液中，染 色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2)离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA ,而不吸附溶液 中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260n

4、m的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应 DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA 纯净A260/A2801.8含RNA杂质，用RNA酶去除。.质粒DNA的酶切鉴定: 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA。.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度。DN

5、砌子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA分子量大小 及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 (迁移速度与分子量的对数 值成反比关系).三、材料与方法：以流程图示意(一)实验材料：. PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液：大肠杆菌 DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T无菌去离子水、x Premix Taq、引物.质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1 (S1)、溶液P2

6、(S2)、溶液P3 (S3)、去蛋白液PE (W1)、漂洗液WB (W2)、洗脱液EB (Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌 DH5 a.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸储水、质粒DNA.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul).琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液(二)实验方法：.实验流程：简述实

7、验内容流程，PCR!作步骤煮菌，PCR(PCRS序最后设4c保温)；PCRK运彳T约2小时，学习PCR理、质粒DNAE取和酶切原理质粒dnAE取(约1小时)酶切操作J保温约12小时，学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理紫外检测定量电泳上样（样品：质粒 DNA PCFSTW,酶切产物，Marker）J电泳仪运行约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存.实验步骤 1) PC网应菌体煮沸10分钟，冷冻，室温下解冻后离心，取上精液。取PCFE应管，用加样枪加入下列各试剂试齐1J灭菌去离子水2*Premix Tap弓 I物 1-SO100 （10弓 I物 2-SO101 （10菌液总体积体积4.5ul1

8、2.5ulmol/L)1.5ulmol/L)1.5ul5ul25ul注意：如配好的反应液较多沾到管壁上，可将 PC网应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪 （PCR仪）上按照以下顺序操作PCFa进行基因扩增i、94c预变性5分钟后开始以下循环;ii、94C、30 秒;iii、55 C、30 秒；iv、72c 1 分钟；v、25个循环vi、72c 5 分钟；vii、4 C 保温。实验过程约1小时30分钟.2）质粒DNA提取与定量：步骤操作流程取1.5ml培养物加入Eppendorf管中13000rpm离心1min,弃上清液加入250小溶7取S1,吹打，使细菌沉

9、淀分散，彻底悬浮加入250小溶7S S2,颠倒46次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮加入350人 溶液S3,立即温和混匀68次。13000rpm离心10min,小心取上清液（700/ ）。将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上精液加入吸附柱中，13000rpm离心3min,弃滤液。加入500仙去蛋白液 W1, 13000rpm离心1min,弃滤液向吸附柱中加入700仙l漂洗液 W2, 13000rpm离心1min ,弃滤液重复步骤8 一次空柱13000rpm离心1min,然后开盖室温放置3min,使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加30口 洗脱缓冲液11（El

10、uent）,室温放置1min, 13000rpm离心1min洗脱质粒 DNA , 保留备用。紫外光吸收法定量检测操作步骤.打开仪器电源开关.根据样品的不同,在仅需控制面版上选择对应的方法组，如恻量质粒DNA瞅度选,恻量RNA浓度选等以此类推.心,选择进入方法蛆后，再根据特定的样品通过上下键 .选择伽所需要的方法，如进入DNA方法蛆后 你所测的样品是质粒DNA就选择蚓方A,如果是单链DNA就选择ssDNA.如果是RNA选择就RNA等 等，以此类推A然后按键（三）确认.,按p3mMer/dihitig键设置样品稀释倍数，在惮出的对话框中逋过（三）艇来转换输 入样品的体积和稀稀样品所用稀释液的体积,

11、按ft键（声）确认”.后推打井仪翳上放置石英比色皿的槽盖.6,按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积白福科放,然后把石英比色皿放入检测槽，技blank犍进行调零8 .按 sample 健体积（世l）9.02.07.0（约 500ng）1.01.020.07.再按照设置的稀释方法.向石英比色皿中加入对应体指的样品.并用微量加样器轻提混勾.，仪器会根据样品的稀释倍数自动计直出样品的最签幡度.3）酶切鉴定在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂 试剂名称无菌水10XM酶切缓冲液质粒DNAHind III（15U/ul）EcoR I（12U/ul）总体积 移液枪轻轻混匀（避免产生

12、气泡）,37C水浴1.5h4）琼脂糖凝胶电泳凝胶准备_胶床准备一铺胶静置 一拔梳子胶床置于电泳槽中一加电泳缓冲液一年电泳取出凝胶凝胶成像系统观察结果电压：80120V 时间：1530分钟注意事项：倒胶时把握好胶的温度，不要高于 60C ,否则温度太高会使制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Geldview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久上样每组加3个样品孔，记住位置第一孔：9质粒DNAW 1/6 loading buffer混匀后上样第二孔：91酶切产

13、物与1 n l 6 loading buffer混匀后上样第三孔：10/PCR物直接上样四、结果与讨论： 结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。（一）实验结果：.PCR反应：溶液体系完成经过PCR扩增后，得到的PCR反应管内溶液呈绿色c.质粒DNA提取与定量：S2混匀后溶液变得经离心分离出无色透培养物在EP管中呈白色，加入溶液S1后细菌沉淀分散，加入溶液 清亮，再加入溶液S3,管内出现白色絮状沉淀，加漂洗液 W2后, 明的上清液与底层的白色沉淀。紫外光吸收法定量检测测量次数质粒DNA浓度（a g/ml）Ratio 值(A260/A280)87.01.7381.

14、11.8178.21.78平均值82.11.773.酶切鉴定：经酶切37 C水浴1.5h后得到无色透明溶液4.琼脂糖凝胶电泳:M: DL5000 DMA Marker1. 4t 7. IQ为质粒Z 5.8, 11为幽切片段3. 6, 7, 12为PCS目的条带0 0。QOmo c-LTOL-h- 05 $ 2 11 5我们小组是10、11、12（二）讨论.A260/A280的比值可以反应DNA勺纯度A260/A280=1.6-1.9 DNA样品较纯，符合实验要求A260/A2801.9 RNA 污染本实验中A260/A280=1.77 说明DNA羊品基本较纯，符合实验要求。.琼脂糖凝胶电泳成像

15、结果 经凝胶电泳后，从成像结果可观察到 DNA Marker 5000、质粒DNA、酶切产物与PCR 产物与发生迁移并各自形成相应条带：PCR产物形成的条带大致位于500bp左右的位置。酶切产物条带可观察到位于 3000bp左右位置的酶切长片段，并隐约可见处于 500bp 位置附近的酶切小片段。酶切小片段成像不明显，原因可能是：上样的时间过长，样本发生溶解扩散，使质粒量减少；点样时，等待时间过久，样品可能在凝胶中扩散；吹打液体时，部分液体可能因为过于激烈而扩散。质粒DNA中出现三条带，分另J对应超螺旋质粒 DNA线性DNAffi开环X尤质粒DNA这 三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，具次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从下到上分别为：超螺旋型DNA线性分子、开环状分子。其中线性质粒 DNA的条带亮度最大，表明其含量最高；而超螺旋 质粒DNA亮度较小，含量较低。（三）思考题：.碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？答：溶液I :螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA勺降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液II :细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III :酸性条件