高级生化试验报告一

1、实验一猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物歧化酶（Superoxide OrgoteinDismutase , SOD）是一种能专一地清除超氧 离子自由基（。2-）的金属酶，他具有抗衰老、抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因 而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所 含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。 Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色； Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机体内O2-的

2、过量和不足均对机 体不利，SOD对过量的O2一的及时清理保证了机体内 O2一的含量相对平衡。机体 内的O2-的形成可分为病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中会形成 一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些 O2-。在某些疾病（如氮中毒、 辐射病等）过程中产生大量的 。2-,如不及时清理，会对细胞损伤。SOD将O2- 歧化为H2O2,而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可以催化过氧化氢分解， 在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料， 从中提取SOD并进行纯化。 酶活力测定可用以下方法：邻苯三分自氧化法、黄喋吟氧化酶法、NBT光还原法、

3、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三分自氧化速率达 50%的酶含量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝 G-250法测定。考马斯蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250）在游离状态下呈紫红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范 围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定， 测定范围1-1000ug。二、实验试剂与器材试齐打1 SOD的提取ACD抗凝剂：柠檬酸10g,柠檬酸钠30g,葡萄糖25g,用适量蒸储水溶 解并稀释至1000m

4、L0.9%NaCl:称取0.9g,溶于100ml蒸储水中。丙酮95%乙醇氯仿2SOD活力测定50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液10mmol/L EDTA钠盐溶液3mmol/L邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）3考马斯亮蓝G-250法测蛋白质考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95% 乙醇中，加入100ml85% （W/V）的磷酸，蒸储水定容至1000ml。此试剂常温下 可保存30天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg,加蒸储水溶解并定 容至100ml。吸取上述溶液40ml,用蒸储水稀释至100ml,即为100ug/ml的标 准蛋白

5、质溶液。器材752分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管；（1ml, 5ml）;离心机； 烧杯（50ml）。三、操作步骤SOD的提取取新鲜猪血20ml（预先按0.15:1 （V/V）的比例加入ACD抗凝剂）,4000r/m, 10min,去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗,4000r/m, 10min,弃上层精液，再加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液重复清洗一次，4000r/m, 10min,得洗净的红血球浓稠液（7.5ml）。向洗净的红血球中加入等体积的蒸储水，剧烈搅拌30min,使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的 0.25倍体积

6、的95%乙醇溶液（3.75ml）和0.15倍 体积的氯仿（2.25ml）,匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min, 4000r/m, 10min,去 变性蛋白沉淀物，得上层液（记体积 V1:7.25ml）、留样1ml。将上层液用多 层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清夜在 65-70。叵温水浴中 进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m, 5min除沉淀，得浅黄色 粗酶液（记体积V2: 5.65ml）,留样1ml。向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱（-20C）中静置1h, 4000r/m, 10min 弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗2次，离心收集

7、沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸储水，备用。（本实验加入3ml蒸 储水进行溶解，记体积 V3： 3ml）2SOD活力测定邻苯三酚自氧化率的测定取 4.5ml 50mmol/L pH8.3 的磷酸缓冲液，4.2ml蒸储水和 1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25c水浴保温20min,取出后立即加入25c 预热过的邻苯三酚溶液0.3ml,迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L HCI作空白，325nm波长下每隔30秒测光密度值一次，整个操作在4min内完成， 计算出每分钟 A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化率控制在 0.070/mi

8、n 左右。酶活力测定操作与1 一致，加入邻苯三酚前，先分别加入50人、40山、20山的SOD样液， 蒸储水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酸后邻苯三酚自氧化率。酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：（A0-Am）/A 0*100%样液稀释倍数单位活性（U/ml） =*反应液总体积数 *50%样液体积其中，A0为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后邻苯三酚自氧化率。总活性（U）=单位活性*酶原液总体积3蛋白质含量测定（考马斯亮蓝 G-250法）标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸播水

9、（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100塞上盖子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在 595nm波长下比色测定 光密度值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白质含量（ug）为横坐标，光密度 值为纵坐标，绘出标注曲线。样品中蛋白质含量的测定将待测的SOD溶解并解释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入50小、 200人、100小 样品提取液，加入相应蒸储水 0.975ml、0.8ml、0.9ml和5ml考马 斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查到相应的

10、蛋白质含量， 计算 其浓度。结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。单位活力（U/ml）总活力比活力（U/mg）= 单位蛋白质浓度（mg/ml）总蛋白质（mg）四、实验结果1测定邻苯三酚自氧化率表1加酶前邻苯三酚溶液光密度值时间（min）0.511.522.533.544.5光密度值（A325）0.0130.0450.0790.1150.1560.2020.2550.3060.364计算得邻苯三酚自氧化率 A=0.074/min2测定加酶后邻苯三酚自氧化率表2加酶后邻苯三酚溶液光密度值时间（min）0.511.522.533.54样1（A 325）0.0190.0270

11、.0400.0580.0760.0910.1120.130样2（A 325 ）0.0530.0670.0810.1000.1200.1400.1590.177样3（A 325）0.0070.0210.0400.0640.0870.1090.1340.158(注：样1、样2、样3分别表示除血蛋白血清、热变性后上清、丙酮沉淀后的样品，下同 )计算得各样品溶液中邻苯三酚自氧化率分别为:Ai=0.032/minA2=0.036/minA3=0.50/min3酶活性单位的计算(单位活性、总活性)表3各样品酶活性单位计算值试齐U加酶前自氧化率A0加酶后自氧化率Am样液体积(ml)酶原液总体积(ml)单位活

12、性(U/ml)总活性(U)样10.0740.0320.057.25227.0271645.946样20.0740.0360.045.65256.7571450.677样30.0740.0500.023324.324972.9724蛋白质含量测定4.1制作标准曲线4.2光密度值IA表4标准蛋白液的595nm处的光密度值蛋白质U里(闻)020406080100光密度值(A595)00.1580.3520.3920.5160.619根据上表绘制标准曲线,如下图:通过公式y = 0.006x + 0.0389计算样品中蛋白质含量，如下表:表5各样品中蛋白质含量样品光密度值蛋白质百里mg样品加入量mL单

13、位蛋白质浓度mg/ml样10.4290.0650.0252.600样20.3810.5700.2000.285样30.2030.0270.1000.2705综上可得本次试验结果总表，如下：表6实验结果汇总酶液总体蛋白质酶活性总活性比活性提纯步骤积（ml）(mg/ml)(U/ml)(U)(U/mg)回收率（）纯化倍数除血蛋白血清7.252.600227.0271645.94687.318一一热变性后上清5.650.285256.7571450.677900.90288.110.3259.113.76丙酮沉淀后的3.000.270324.324972.9721201.20067.1 （与样2比较）1.33（与样2比较）五、分析讨论1、本实验纯化过程中，蛋白质含量、酶总活性逐渐降低，酶活性、比活性 逐渐增加，表明纯化倍数逐渐增大，实验基本成功。2、本实验中，丙酮沉淀后的酶回收率较低，说明实验操作过程还需注意， 应争取通过严谨的实验操作以提高酶回收率。3、本实验中蛋白质标准曲线 R2=0.9719,表明用所得函数计算出的样品蛋白 质含量较可靠；操作中应重复测量光密度值，用平均值作图，以期得出更为准确 的数学函数；样品1中的蛋白质含量偏高，表明在提取 SOD第