第8章.色谱法概论（新）

1、第9章 色谱法概论 （Chromatography） 9-1 色谱法的起源、历程及分类9-2 色谱过程与术语色谱法是什么样的方法呢？ 类似于经典的分离方法，如 1.沉淀法：利用各组分溶解度的差异而进行分离。 2. 蒸馏法：利用各组分沸点的差异进行分离。 3. 萃取法：利用各组分在水相和有机相（互不相溶） 的两相）中分配系数的差异进行而分离。 定义：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。 它是利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的迁移，最终达到相互分离的目的。 色谱法已广泛用于各个领域，是多组分混合物首选的分离分析方

2、法。以中国药典2005版为例，一部收载中药1146个品种，用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有1523项，用高效液相色谱进行定量分析的有479种518项，用气相色谱进行检测的有47种。二部收载的有1967个品种，采用高效液相色谱法的品种有848种。现在色谱法已形成一门专门的科学。 9-1 色谱法的起源、历程及分类一、色谱法的起源 1903年3月21 日俄国植物学家茨维特 Michael Tswett（1872-1919）他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度

3、不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。石油醚(流动相)色谱带碳酸钙粉末(固定相)植物叶提取液碳酸钙粉末（固定相）色素混合液石油醚 (流动相）色谱柱色带色谱色：颜色谱：图谱1903年，Tsweet发明的色谱法植物色素分离图示二、色谱法的历程1938年：Izmailov等人将糊状Al2O3浆液在玻璃板上铺成均匀薄层，用于分离植物中的药用成分，即今日用的薄层色谱。（用于薄层的材料已发展至多种：如硅酸、聚酰胺等）。 1931年 Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了 -,- ,-胡萝卜素 等60 多种植物色素1944年：Con

4、sden，Gordon和Martin将纤维（滤纸）作固定载体，以水吸附在滤纸上作溶剂，根据组分在两相中溶解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离，称之为纸色谱法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动相，用来分离脂肪酸混合物即今日的气液色谱。1941 年 Martin 和 Synge建立了液液分配色谱法并 提出气相色谱的设想 在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。

5、1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。1937-1972年，15年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！1955年第一台商品GC问世；标志现代色谱分析的建立。1957年：Golay首先应用小口径毛细管柱进行色谱分离实验，结果证明了它具有高分辨率和高效能 即为今日的高效毛细管气相色谱法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化学惰性的多孔凝胶作固定相的空间排阻色谱法，根据固定相孔隙尺寸不同而具有不同的选择性渗透能力，从而对分子量分布不同的样品实现了分离。可用于测定聚合物的相对分子质量的的分布。60年代末，出现了HPLC；80年代，超临界流体色谱；Jorgeson

6、 发展了毛细管电泳90 年代后期毛细管电色谱21 世纪 ，出现了UPLC；使得色谱柱的分离效率、检测灵敏度大大提高，分析时间大大缩短，分离分析的成本大幅下降。 我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性、高效能 、高灵敏度、分析速度快、应用范围广有效分离的量少对未知物分析的定性专属性差1按两相分子的聚集状态分：流动相 固定相 色谱类型液相色谱液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体

7、 气-液色谱气相色谱三、色谱法的分类2按分离机制分：键合相色谱法（bonded phase chromatography，BPC）毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）毛细管电色谱法（capillary electro-chromatography， CEC）吸附色谱法（adsorption chromatography）分配色谱法（partition chromatography）空间排阻色谱法（steric exclusion chromatography，SEC）离子交换色谱法（ion exchange chromatography，IEC）3. 按操作

8、形式分类 纸色谱法（PC） 平面色谱 薄层色谱法（TLC） LLC LSC SEC IEC GSC GLC LSC BPC SEC柱色谱法 GC经典液相色谱HPLCSFCCE，CEC色谱法色谱法的现状和发展趋势现状：理论、技术和方法趋于成熟发展：新型固定相和检测器的研制 色谱新方法的研究 色谱联用技术 色谱专家系统 9-2 色谱过程与术语一、色谱过程以吸附色谱为例见图示 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离色谱流出曲线和色谱峰二、色谱图工业二甲苯中的杂质分析从色谱图上，可以得到许多重要信息： （l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数 （2）

9、根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析 (3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析 （4）色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据 1.基线 在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线三、常用术语与测定参数噪声和漂移 在没有样品进入检测器的情况下，由于检测器本身及其它操作条件（如柱内固定液流失，橡胶隔垫流失、载气、温度、电压的波动、漏气等因素）使基线在短时间内发生起伏的信号，称为噪声。（noise，N），单位用mV或pA表示。 基线随时间向一个方向的缓慢变化称为漂移（drift，d），单位用mVh1或 pAh

10、1表示 tC2峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离称为色谱峰高，用表示。如图9-3中BA段。3色谱峰区域宽度 色谱峰宽有三种表示方法：（1） 标准差 正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即正常峰0.607倍峰高处峰宽的一半。 的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。 （2）半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，它与标准偏差的关系是： W1/2 = 2.355（3） 峰宽W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，它与标准偏差的关系是： W = 4或 W =1.699 W1/2 h0.882hw=1 0.607h0.50h0.344h0.134h0.044hw=2 (拐点)w=2.354 w=3

11、 w=4 w=5 Wb=4 响应值或浓度时间或体积A=1.065(h)(W1/2)第11章113 正常峰（对称）0.95 T 1.05拖尾因子计算公式4拖尾因子 T0.95 T1.05非正常峰前沿峰拖尾峰 分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。（1）死时间 tM (t0)5.保留时间（2）保留时间 tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间。它是色谱法的基本定性参数。保留时间的单位分或秒tR = tR tM 组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，（3）调整保留时间 tR

12、所以tR实际上是组份在柱中固定相停留的时间 色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及进样器和检测器的空间的总和当后叁项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速Fc（mLmin）计算： VM = tM Fc （1）死体积 VM6保留体积（2）保留体积 VR 从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR 的关系如下： VR = tRFC 因为流动相流速大，保留时间短，但两者的乘积不变， 因此VR与流动相流速无关。 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR= VR - VM（3）调整保留

13、体积VR 7相对保留值i,s 由于相对保留值只与柱温、流动相及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是GC中，广泛使用的定性参数。 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 。 某组份i 的调整保留值与参照（基准）物质S的调整保留值之比，称为相对保留值：8. 选择性因子混合物色谱图中组分2与组分1的调整保留时间之比 如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数或容量因子是色谱分离的前提！项 目相对保留值选择因子值 域1ris或ris 1

14、1用 途定性参数，用于物质的定性。通常不用于衡量色谱柱的选择性。非定性参数，仅用于衡量色谱柱的选择性。注意选择因子与相对保留值的区别!（ 1）分配系数 K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 9.分配系数与分配比（2）分配比k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k 值越大，

15、说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。K 值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。 Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在空间排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。（3）分配系数K与容量因子k的关系 其中称为相比（率），它是反映各种色谱柱型 特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。 10保留值与容量因子的关系 当物质在两相间的分布达到动态平衡时，从微观

16、出发，一个样品分子在流动相中出现的几率(即在流动相中停留的时间分数)可用 表示。若 =1/3，则表示这个分子有1/3的时间在流动相，而有2/3的时间在固定相。 从宏观出发，对于大量的溶质分子而言，则表示有1/3的量在流动相，有2/3（即1- ）的量在固定相中。因此（9-15）整理上式即得 （9-16） 当 =1时，溶质全部随流动相前移，不能进入固定相，不被保留； 当 =0时，溶质全部进入固定相，不随流动相前移。可见 在0l之间，它可用于衡量溶质被保留的情况，所以 又称保留因子。 也可用于表示溶质分子流经整个柱的相对移动速度。若 =1/3，则表示溶质分子在柱中移动的速度相当于流动相移动速度的1/3。因为tM表示流动相分子流经整个色谱柱的时间，所以溶质分子流经同样路程的保留时间tR将是tM 的l 倍。即（9-17）