《蛋白质工程讲义》word版

1、蛋白质工程技术实 验 讲 义杨丙晔厦门医学高等专科学校目 录技术路线介绍与实验试剂准备.2学时实验一 蛋白质的原核诱导表达及SDS胶的配制.4学时实验二 蛋白质SDS电泳.4学时实验三 电泳胶的染色.3学时实验四 表达菌液的破碎和总蛋白的提取.4学时实验五 表达蛋白浓度的测定. 3学时实验六 金属螯合层析纯化外源表达蛋白.6学时实验七 纯化蛋白的透析. 3学时实验八 组织蛋白的提取和电泳分离。.3学时实验九 Western blotting. .8学时实验十 蛋白质组样品的质谱制备.8学时实验一 蛋白质的原核诱导表达及SDS胶的配制一、实验目的1、掌握蛋白质的原核诱导表达及诱导机理2、熟悉SD

2、S胶的配制方法二、实验原理利用乳糖的类似物IPTG对通过基因工程构建好外援表达基因进行蛋白的诱导表达，诱导的原理为乳糖操纵子调控原理：乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调

3、节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。三、实验器材与试剂1、菌种：原核表达菌株：大肠杆菌BL212、器材与试剂（1）器材：低温离心机，控温摇床，离心管。超净工作台，放锥形瓶的摇床。（2）试剂：LB培养基：胰蛋

4、白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH调节到7.2。121。C灭菌，20min；无水乙醇，新的1.5ml离心管，1ml和200ul的枪和枪头。四、操作步骤挑单菌落至1ml LB/Amp(50ug/ml)液体培养基，37摇菌过夜按1：100比例转接到LB/Amp (50ug/ml)，37振荡培养24hrs培养到时间后，取两管1ml的菌液离心收集剩下的培养液加IPTG至终浓度0.51.0mM，37振荡继续培养之后每隔1h取样一管，连续取诱导后4-5hrs样品，剩余样品收集细菌冷藏备用。SDS胶的配制：把玻璃板洗净，用无水乙醇过一下，加快晾干。在灌胶装置上把密封胶条放好，玻璃板夹好，一定要对

5、平。配5ml 10分离胶（分离范围2070kD）：1.9ml ddH2O、1.7ml 30Acr-Bis、1.3ml 1.5MTis-Hcl(Ph8.8)、50l 10SDS最后加50l 10AP、3l TEMED，边加边混匀把分离胶用微量移液器沿一侧夹层垫片灌进夹层，注意枪头不要用力压玻璃板。灌至液面离外层玻璃顶端约2.5cm加无水乙醇约0.5-1cm高30min后，胶凝固，有明显的折射线。倒掉水，用滤纸吸干配2.5ml5浓缩胶：1.7mlddH2O、0.42ml30Acr-Bis、0.31ml1.0MTis-Hcl(PH6.8)、25l 10SDS最后加25l 10AP、2l TEMED，

6、灌胶至满将梳子斜着下插，可以防止气泡，插入约1cm约2030min后凝固，小心拔出梳子。实验二 蛋白质SDS电泳一、实验目的1、掌握利用SDS电泳技术分析蛋白质的表达情况2、熟练掌握蛋白质SDS胶的配制以及电泳分离技术3、学习蛋白质SDS电泳分离的技术原理二、实验原理利用SDS电泳技术对我们上节实训课所收集获得菌液蛋白进行分析，分析诱导表达的蛋白所表达的趋势与时间的关系。SDS电泳原理：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，

7、而长轴与分子量大小成正比。在SDS中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。三、实验器材与试剂1.试剂：ddH2O、30Acr-Bis、SDS，AP（过硫酸铵）、TEMED，甘氨酸，无水乙醇，甲醇，乙酸。1Running Buff

8、er （Tris甘氨酸电泳缓冲液）：1.5g Tris base、7.2g Glycine，溶解后补水至500ml，在溶液中加入0.5g SDS样品的准备：样品从冰箱中去除，在滤纸上倒置离心管充分流干，加入30ul的PBS，加入30ul的2XSDS上样缓冲液，煮沸5min。3000rpm离心 4min，轻轻放置在桌子上。脱色液：甲醇：水：乙酸=5：4：1 两组配100ml2.器材：新的1.5ml离心管，1ml和200ul的枪和枪头，放锥形瓶的摇床，电磁炉，锅，浮漂，培养皿，电泳仪。四、操作步骤SDS胶的配制及电泳：把玻璃板洗净，用无水乙醇过一下，加快晾干。在灌胶装置上把密封胶条放好，玻璃板夹好

9、，一定要对平。配5ml 10分离胶（分离范围2070kD）：1.9ml ddH2O、1.7ml 30Acr-Bis、1.3ml 1.5MTis-Hcl(Ph8.8)、50l 10SDS最后加50l 10AP、3l TEMED，边加边混匀把分离胶用微量移液器沿一侧夹层垫片灌进夹层，注意枪头不要用力压玻璃板。灌至液面离外层玻璃顶端约2.5cm加无水乙醇约0.5-1cm高30min后，胶凝固，有明显的折射线。倒掉水，用滤纸吸干配2.5ml5浓缩胶：1.7mlddH2O、0.42ml30Acr-Bis、0.31ml1.0MTis-Hcl(PH6.8)、25l 10SDS最后加25l 10AP、2l T

10、EMED，灌胶至满将梳子斜着下插，可以防止气泡，插入约1cm约2030min后凝固，小心拔出梳子。用1Tris甘氨酸电泳缓冲液冲洗并覆盖。样品的准备，样品从冰箱中去除，在滤纸上倒置离心管充分流干，加入30ul的PBS，加入30ul的2XSDS上样缓冲液，煮沸5min。3000rpm离心 4min，轻轻放置在桌子上。待样品处理完毕，将胶板安到电泳槽中，灌1Tris甘氨酸电泳缓冲液，先倒里面，淹没上槽的钵金电极，剩下的倒入下槽用20到200ul的枪取2030ul样品等体积加入加样孔，速度要快，减少样品扩散。剩余空样品孔加入等体积1SDS凝胶加样缓冲液80V电泳，等染料从浓缩胶进入分离胶，将电压调至

11、130V，继续电泳至染料到达凝胶底部在装有蒸馏水的盆子中，小心把胶剥下。实验三 电泳胶的染色一、实验目的掌握蛋白质电泳凝胶的银然的方法熟悉蛋白质凝胶考马斯亮蓝染色的方法二、实验原理银然：因染色液中的阴离子（Ag+）可与蛋白质形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银离子，可把蛋白质电泳的条带染色成黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。三、实验器材与试剂试剂：硫代硫酸钠，乙醇，乙酸，甲醛 37%，硝酸银，碳酸氢钠，Na2EDTA；固定液（200ml）：乙醇，100ml；乙酸，20ml；水，80ml器材：培养皿，水平摇床，分析天平，量筒，照相机。四、操作步骤考染：将跑好的蛋白胶加入胶盒

12、中，加入考马斯亮蓝染色液，染色1-2h。配制脱色液：50乙醇、10乙酸、40ddH2O然后换成脱色液脱色，中间换1-2次脱色液，脱色2-4h，拍照，观察结果。银然：固定：加入固定液，固定2h。冲洗：固定后35%乙醇冲洗2-3次，每次15min （每组150ml） 敏化：配制敏化液： 硫代硫酸钠0.025g到50ml超纯水中。超纯水清洗三次，每次5min银然试剂：硝酸银0.1g 溶解于50ml超纯水中，使用前加入36ul甲醛超纯水清洗二次，每次10-15s显色：碳酸氢钠3g 溶解到50ml超纯水中，使用前甲醛加入24ul，敏化液1ml 显示时间一般是5min ，看情况而定终止：Na2EDTA 1

13、.88g 溶解于50ml水中，终止15min超纯水洗三次，每次5min。拍照：有必要的话，3%乙醇冷藏保存。实验四 表达菌液的破碎和总蛋白的提取一、实验目的掌握菌液超声破碎的方法学习蛋白裂解液的主要组成部分及功能作用二、实验原理超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。我们就是利用超声效应中的机械效应，超声仪器将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅

14、速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。三、实验器材与试剂试剂：配制细菌裂解液：50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系；150 mM NaCl 等渗体系；1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 ；1% Triton x-100 破坏细胞；0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂；6M尿素；器材：超声破碎仪，离心管，离心机。四、操作步骤配制细菌裂解液沉淀好的细菌加入裂解液重悬细菌，等分两管，分两组使用。将装有菌液的离心管周围用碎冰进行包裹，加入到超声仪器中，注意超声探头在超声过程中避免触碰离线管的管壁和底部。打开超声仪器，将参数设置好（功率为30%，超声破碎5

15、s，间歇5s，破碎15min。）打开超声开关，开始超声破碎，要主要观察离心管的位置，保证其稳定性。将破碎后的菌液取出，转移到离心机合适的离心管中，用裂解液每两组进行重要的平衡，12000rpm 离心10min。将上清取出，一部分放到干净的1.5ml离心管中，剩余部分装到50ml离心管中，样品冷冻保存下次待用。实验五 表达蛋白浓度的测定一、实验目的熟悉双缩脲法测定蛋白质浓度掌握bradford方法测定蛋白质浓度二、实验原理双缩脲是两分子尿素缩合而成的化合物，双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，在

16、碱性溶液中也能与铜离子形成紫红色络合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可以利用比色法测定蛋白质浓度。考马斯亮兰G-250燃料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置从 465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸和 芳香族氨基酸碱基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，在一定范围内与蛋白质浓度成正比，利用建立浓度与吸光度值的标准曲线，从而计算蛋白质的浓度。三、实验器材与试剂试剂：双缩脲试剂盒和bradford试剂盒器材：比色皿，普通分光光度计，酶标仪四、操作步骤双缩脲法测定：测定管：细菌蛋白提取液测

17、定2个，组织提取液测定1个，标准品稀释液1倍和2倍稀释样品。根据下面图表把试剂加入到各个管子中：混匀各管中的试剂，然后将试剂管放到37度水浴锅中加热20min。取出试剂，将试剂液转移到比色皿中，提前打开普通分光光度计，540nm处检测各管0D值。利用下面公式计算测定管各管的浓度。Bradford法测定：测定管：细菌蛋白提取液测定2个，组织提取液测定1个，标准品稀释液1倍和2倍稀释样品。根据下面图表把试剂加入到各个管子中：编号1（ul）23456789BSA(标准)02468101200裂解液22222222（样品）2（样品）水989694929088869898工作液1000100010001

18、00010001000100010001000各管试剂混匀后，取200ul转移到96孔板中，15中之内用酶标仪检测各孔在595nm处的吸光值制作标准曲线，利用标准曲线公式计算各测定管的吸光值。实验六 金属螯合层析纯化外源表达蛋白一、实验目的学习掌握金属螯合层析的原理掌握金属螯合层析纯化外源表达蛋白的方法二、实验原理固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，六聚组氨酸带有比较多的负电荷，是强的电子供体，与镍等金属离子具有较强的结合

19、能力。带有六聚组氨酸标签的融合蛋白结合在镍柱的表面。利用更强的电子供体（咪唑），竞争性的结合把蛋白洗脱下来。三、实验器材与试剂器材：6ml层析柱，离心管，水平摇床，铁架台，枪和枪头，分析天平。试剂：琼脂糖介质，硫酸镍，咪唑，SDS，氯化钠，Triton-100，PMSF。四、操作步骤洗净空层析柱，缓慢加入稀糊状Chelating Sepharose Fast Flow介质，将层析柱固定在铁架台上。打开底部塞子，保护液液体缓慢流出。介质均匀沉降到层析柱里的分子筛上。加入bufferA溶液冲洗介质2-3次。加入两倍柱床体积 0.2M NiSO4过柱，加入NiSO4后先保持几分钟再将溶剂流出。用bu

20、fferA洗脱多余的NiSO4，洗脱3次，第一次bufferA保持一会。将镍柱转入50ml离心管中，加入提取的总蛋白混合，4度，在摇床上滚动结合过夜。将结合蛋白的镍介质加入层析中，等待多余蛋白液流出加入bufferA溶液，洗涤2次。加一定量（根据柱体积来算）的入80mM咪唑的bufferA溶液，洗脱2次（循环加入）。加入一定量的100mM咪唑的bufferA溶液，洗脱2次（循环加入）。再用200mM咪唑的bufferA洗脱3次，去除其他蛋白。恢复层析柱。实验七 纯化蛋白的透析一、实验目的学习和掌握蛋白质透析的基本原理和操作方法二、实验原理透析（dialysis）是通过小分子经过半透膜扩散到水（

21、或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。蛋白质属于生物大分子物质，不能通过半透膜，而其它的像盐离子这些小分子物质可以通过半透膜，这样通过更换透析外面溶液，多次去除溶液中的小分子物质。三、实验器材与试剂2、器材：透析袋，烧杯，玻璃棒，磁力搅拌器及搅拌子，刻度试管及试管架，滴管。试剂与材料3、试剂：50%乙醇，2%碳酸钠溶液，1mmol/L EDTA溶液，10%硝酸溶液，1%硝酸银溶液。 四、操作步骤蛋白质透析将透析管剪成适当长度，即形成透析袋。在大体积2（m/V）碳酸氢钠和1mmol/LEDTA（PH*8.0）中将透析袋煮沸10min，将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。将透析袋置1

22、mmol/L EDTA（PH*8.0）中煮沸10min将透析袋冷却，存放于4摄氏度，应确保透析袋始终浸没在液体中。重要：从此步起用透析袋时一定要带手套操作依次用50%乙醇、0.01M碳酸氢钠和0.001MDTA重新一遍。在使用前再用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。取出预处理好的透析袋，检查是否完好，用水清洗干净，结扎管的一端，向其中加入纯化的的蛋白质溶液，放在盛有蒸馏水的烧杯中，于磁力搅拌器上搅拌。中间每间隔20min更换一次外面的水溶液（更换的水溶液保存），持续约1小时左右。分别从三次更换的水溶液中取水1mL，加入10%硝酸溶液0.5mL振荡摇匀成酸性，再加入1%硝酸银溶液0.5mL，检查氯离子

23、的存在，评价氯化钠是否可以透过透析袋。实验八 组织蛋白的提取和电泳分离一、实验目的学习和掌握普通动物组织蛋白质的提取方法二、实验原理采用组织匀浆的方法将组织细胞打碎，用裂解液将组织蛋白溶解出来。三、实验器材与试剂器材：剪刀，离心管，组织匀浆机，低温高速离心机，电泳仪。试剂：PBS溶液：0.01M PBS （PH 7.2）NaCl，8g；KCl，2g；KH2PO4， 2.7g；Na2HPO4.12H2O，35.8g。加水到800ml，用1M的NaOH调节PH 值至7.2， ddH2O定容至1000ml，高压灭菌；PMSF试剂。1Running Buffer （Tris甘氨酸电泳缓冲液）：1.5g

24、 Tris base、7.2g Glycine，溶解后补水至500ml，在溶液中加入0.5g SDS样品的准备：样品从冰箱中去除，在滤纸上倒置离心管充分流干，加入30ul的PBS，加入30ul的2XSDS上样缓冲液，煮沸5min。3000rpm离心 4min，轻轻放置在桌子上。四、操作步骤称取0.2g组织块，用剪刀把组织块剪成细小的块状。加入PBS缓冲液1.2ml（每克组织6 ml PBS），PMSF（每克组织30l，1M PMSF），利用组织匀浆机进一步匀浆（15,000转/分*2分钟，匀浆30s停顿30s）在冰上匀浆维持4。移入离心管4 约12,000转（约20,000 g），离心15分钟

25、将上清液转移到离心管中，分装-20保存进行Bradford比色法测定蛋白质浓度取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2电泳加样缓冲液沸水浴中5分钟组装电泳装置，上样， 电泳（浓缩胶80V，分离胶130V）电泳完成后，将电泳胶取下用电泳缓冲液清洗下，用保鲜膜包裹起来放到4度冰箱保存，下次实验待用。实验九 Western blotting一、实验目的学习蛋白质印记的原理掌握蛋白质印记操作方法二、实验原理通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特

26、点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。三、实验器材与试剂器材：转膜仪器，玻璃棒，培养皿，滤纸，烧杯，量筒。试剂：-actin一抗，抗一抗二抗，PVDF膜，BSA，ECL显色试剂盒。5%BSA: 5gBSA溶解于100ml的TBS溶液转印缓冲液：3.03gTris+14.42g甘氨酸，加入200ml甲醇，加水溶解后，定容到1L.TBST溶液：0.01M TBST:1.21g Tris，5.84g氯化钠，加入800ml的水溶解，调节PH到7.5，加入0.05%Tween-20，定容到1L.四、操作步骤取出保存的凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗一下，（滤纸要在缓冲液

27、中浸泡完全湿润）剪取大小合适的PVDF膜，在培养皿中加入少许甲醇，浸泡1-2min。取出PVDF膜转移到转移缓冲液中湿润一会。按滤纸/凝胶/膜/滤纸的顺序叠加，在转移缓冲液中赶走中间可能夹杂的气泡。将上述叠加滤纸和膜放到转膜装置中，凝胶的一面朝向阴极。湿转的方法：将滤纸和膜装置放入到电转移槽中，加入电转移缓冲液，接通电源进行电转膜半干转印的方法：将滤纸和膜装置在转移缓冲液中湿润后，赶走气泡，放入到半干转印装置中，进行电转膜。转膜后，将膜取出转移到盒子中，加入5% BSA溶液，常温下水平摇床摇动封闭1-2小时或4度封闭过夜。用TBST溶液清洗膜两次，每次5min加入一抗溶液，常温下水平摇床摇动孵育1-3h。用TBST溶液清洗膜三次，每次10min加入二抗溶液，常温下水平摇床摇动孵育45min-1h。用TBST溶液清洗膜二次，每次5min，TBS溶液清洗膜一次配制ECL显色溶液，将显色液加入到PVDF膜上，停留1-2min，暗室中蛋白条带的荧光显色情况或用仪器进行拍照。实验十 蛋白质组样品的质谱制备一、实验目的学习蛋白质组样品的制备原理掌握蛋白质组样品的质谱制备方法二、实验原理利用丙酮沉淀蛋白的方法提取样品的全蛋白，利用bradford方法测定蛋白样品浓度，利用蛋白酶对全蛋白样品进行酶切处理，利