软籽石榴品种纤维素合成酶基因的克隆与序列分析开题报告

1、枣 庄 学 院本科生毕业设计（论文）开题报告 题目: 软籽石榴品种纤维素合成酶基因的克隆与序列分析 姓名： 姜蓓蓓 学号： 201207120210 年级： 12 级 专业： 生物科学 指导教师：姓名 马 丽 职称 副教授 学科： 生物化学与分子生物学 枣庄学院教务处制2013年 9 月 25 日说 明一、开题报告前的准备毕业设计（论文）题目确定后，学生应尽快征求指导教师意见，讨论题意与整个毕业设计（论文）的工作计划，然后根据课题要求查阅、收集有关资料并编写研究提纲，主要由以下几个部分构成：1研究（或设计）的目的与意义。应说明此项研究（或设计）在生产实践上或对某些技术进行改革带来的经济与社会效

2、益。有的课题过去曾进行过，但缺乏研究，现在可以在理论上做些探讨，说明其对科学发展的意义。2国内外同类研究（或同类设计）的概况综述。在广泛查阅有关文献后，对该类课题研究（或设计）已取得的成就与尚存在的问题进行简要综述，只对本人所承担的课题或设计部分的已有成果与存在问题有条理地进行阐述，并提出自己对一些问题的看法。3课题研究（或设计）的内容。要具体写出将在哪些方面开展研究，要重点突出。研究的主要内容应是物所能及、力所能及、能按时完成的，并要考虑与其它同学的互助、合作。4研究（或设计）方法。科学的研究方法或切合实际的具有新意的设计方法，是获得高质量研究成果或高水平设计成就的关键。因此，在开始实践前，

3、学生必须熟悉研究（或设计）方法，以避免蛮干造成返工，或得不到成果，甚至于写不出毕业设计（论文）。5实施计划。要在研究提纲中按研究（或设计）内容落实具体时间与地点，有计划地进行工作。二、开题报告1开题报告可在指导教师所在教研室或学院内举行，须适当请有关专家参加，指导教师必须参加。报告最迟在毕业（生产）实习前完成。2本表（页面：A4）在开题报告通过论证后填写，一式三份，本人、指导教师、所在学院（要原件）各一份。三、注意事项1开题报告的撰写完成，意味着毕业设计（论文）工作已经开始，学生已对整个毕业设计（论文）工作有了周密的思考，是完成毕业设计（论文）关键的环节。在开题报告的编写中指导教师只可提示，不

4、可包办代替。2无开题报告者不准申请答辩。一、选题依据（拟开展研究项目的研究目的、意义）石榴(Punica granatum L)为石榴科石榴属植物。石榴是一种药、食两用植物，大多数鲜食，不仅营养丰富，而且是历代药典中的重要中药，现代科学研究也证实，石榴果实在预防和治疗心脑血管疾病、癌症等方面有特效。石榴籽占石榴果实总重12.54%，而其中纤维素的含量为58.76%，因而影响了对石榴果实的食用效率。本课题通过对石榴纤维素合成酶基因序列的分析，为进一步对该基因进行敲除或使其沉默等基因工程手段来调控其表达奠定基础。二、文献综述内容（在充分收集研究主题相关资料的基础上，分析国内外研究现状，提出问题，找

5、到研究主题的切入点，附主要参考文献）纤维素的基本单位是吡喃式D-葡萄糖，以-1,4糖苷键相连,其葡萄糖残基约为2 0002 500个。植物中的纤维素主要是以小微纤丝的形式存在,一般微纤丝是由36根-1,4葡糖苷链结晶而成，它是植物细胞里的主要成分。石榴果实营养丰富，维生素C含量比苹果、梨要高出一二倍。石榴种子具有一层较厚的内种皮，主要为石细胞组成，具有一定的硬度，不仅影响石榴果实的食用品质, 而且影响其加工品质。石细胞的次生壁主要成分为纤维素，纤维素合成过程中的一个最重要的酶纤维素合成酶(Cellulose synthase，Ces)，最先是在木醋杆菌(Acetobacter xylinum)

6、中发现，环二鸟苷酸激活木醋革兰氏阴性菌的纤维素生物合成，起到促进纯化纤维素合酶、克隆编码催化亚基的基因、调控纤维素微丝分泌和结晶的作用。纤维素合成酶基因编码纤维素合酶的催化亚基，纤维素合成酶基因的大小范围从3. 5kb到5. 5kb，有9 13个内含子，它们转录的范围从3. 0kb到3. 5kb,，其内含子和外显子的边界区域是高度保守的，基因结构的差异主要在于内含子的多少，植物CesA 家族的成员在9851088氨基酸，序列同源性的范围是53%98%。 植物纤维素合成酶的N末端一段氨基酸可形成一个特殊的结构域，类似于锌指状或LIM转录因子构向，此种该结构域具有保守序列CxxC（半胱氨酸氨-xx

7、-半胱氨酸氨），与蛋白间的相互作用有关，是维持纤维素合成酶复合体稳定结构的重要功能区。其次，植物纤维素合成酶包含有2个高变区，其中一个在N端，约150个氨基酸残基，富含酸性氨基酸，其功能还不清楚。另一个在A区与B区之间，约50个氨基酸。A区和B区是植物纤维素合成酶基因所特有的保守区, A区含有几个保守的天冬氨酸残基, 排列特征为Dx.xDxD（D 为天冬氨酸）。B区除含有一个保守的天冬氨酸残基外，还有另一个序列QxxRw。现认为A区可结合纤维素合成的底物： 尿苷二磷酸-葡萄糖，而B区则与纤维素合成酶的催化活性有关。第三，共有8个跨膜区，其中有两个在N-末端，另外6个在C-末端。N端和C端跨膜结

8、构域之间约有550个氨基酸长度的间隔，具有典型的亲水性，可形成环状（loop）结构延伸至细胞质，称为胞内区。跨膜区是-1，4-葡萄糖苷链穿过质膜进入细胞壁的重要通道。以色列Hestrin小组是以醋酸杆菌为模式研究纤维素体外合成的先驱。该小组建立了醋酸杆菌生产纤维素的最佳模式，发现了纤维素合成酶的激活因子 cyclic dliguanylic acid, 提出了一条体外高效合成纤维素的新途径, 进而导致纤维素合成酶基因的克隆。田志坚等人以苎麻 Boehmeria nivea (Linn.) Gaud. 栽培种湘苎3号为材料， 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基

9、因BnCesA1 5端450 bp序列以外的全部cDNA序列，序列长3276 bp，编码一段938 个氨基酸的蛋白质。李春秀等人以毛白杨形成层为材料，通过简并引物RT-PCR结合RACE技术克隆了毛白杨纤维素合成酶基因 (PtoCes A1 )，序列分析表明该基因序列3215bp，与欧洲颤杨的P tCesA1基因同源性为97 %具有开放的阅读框，编码区在 522985碱基之间, 编码区为2925bp。张智俊等人按胡迎春等（1996）建立的方法将cDNA文库重组子进行矩阵排列，保存于96孔板。根据植物CesA基因保守序列设计两对引物，以文库矩阵中的菌液为模板进行 PCR 筛选，获得含有毛竹Ces

10、A基因的阳性克隆。杜亮亮等人根据绿竹纤维素合成酶( cellulose synthase)基因保守区序列设计引物，以雷竹cDNA为模板，采用PCR方法，成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列，长度为3385 bp，共编码1056个氨基酸，将其命名为PpCes A1基因。目前，多个物种的纤维素合酶基因已经通过简并引物RT -PCR结合RACE技术被成功克隆，并已克隆出多个桉树、杨树的纤维素合酶基因7。但是对于石榴纤维素合成酶基因的分离与克隆还没有相关的研究。本研究课题以石榴嫩枝叶为原料，进行总RNA的提取、引物设计，通过简并引物RT-PCR结合RACE技术获得PCR产物，连接，酶切，感受态

11、细胞制备，质粒DNA的提取，最后进行蓝白斑筛选鉴定。通过石榴纤维素合成酶基因的克隆，为揭示石榴籽粒的硬度的分子机理及将来的基因调控提供理论基础。参考文献:1 周晓馥,王景余,王兴智.植物纤维素合成酶基因的研究进展M.遗传,2002,24(3):376-378.2朱乾浩,汪若海.高等植物纤维素合成的最新研究进展J.生命科学,2000,12(5):210-213.3 李春秀,齐力旺,王建华,等.植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成J.生物技术通报,2005,4:5-11.4 程曦,郝怀庆,彭励.植物细胞壁中纤维素合成的研究进展J.热带亚热带植物学报,2011,19(3):283-290.5 张智

12、俊,杨洋,河沙娥,等. 毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的克隆及组织表达谱分析J.园艺学报,2010,37(9):1485-1492.6 魏建华,宋艳茹.植物纤维素合酶基因研究进展J.植物学通报,2002,19(6):641-649.7 黄青云,张党权,谷振军,等. 纤维素合成酶及其在基因工程中的应用J.经济林研究，2009,27(2):131-136.8 邓小波,胡尚连,曹颖. 绿竹与毛竹纤维素合成酶(CesA)的生物信息学分析J.福建林学院学报,2011,31(1):84-90.9 李益,胡尚连,卢学琴,等.植物纤维素合成酶基因的进化分析J.华北农学报,2008, 23(2):101-10

13、5. 10 许雷,刘一星,方连玉. 大青杨纤维素合成酶 PuCesA6 基因 cDNA 的克隆及序列分析J.西南林业大学学报,2012,10(5):26-32.11 田志坚，易蓉,陈建荣,等.苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析J.作物学报,2008,34(1):76-83.12 邰付菊,李学宝.植物纤维素生物合成及其相关酶类J.细胞生物学杂志,2004,26:490-494.13 李春秀,齐力旺,王建华,等. 毛白杨纤维素合成酶基因(PtoCesA1)克隆、序列分析及其植物表达载体的构建M.中国生物工程杂志,2006,26(2):49-52.14 李学俊,李新宇,李迟园,等.大麦纤维

14、素合成酶截短体的重组表达及多克隆抗体制备J.西北农业学报,2011,20(8):66-70.15 冯玉增,宋梅亭.我国石榴生产现状与发展建议J.林业科技开发,2000,14(5):7-9.16 薛永常,刘长斌,聂会忠.欧美杨 107次生木质部纤维素合酶基因片段的克隆及序列分析J.辽宁林业科技,2008,4:14-16.17 杜亮亮,鲁专,金爱武. 雷竹纤维素合成酶基因 cDNA克隆与表达分析J.江西农业大学学报,2010,32(3):0535-0540.18 孟成生,王志伟,张俊红,等.棉花与拟南芥纤维素合成酶基因家族的生物信息学比较J.贵州农业科学,2012,40(7):39-41.19 彭

15、沙沙,童再康,黄华宏. 杉木纤维素合成酶类似蛋白基因 ClCslD1的克隆及其生物信息学分析J.浙江农林大学学报,2012,29(1):1-6.20 刘小阳,李玲,宗梅,等. 梨果实石细胞含量分布及其对梨品质的影响J.安徽农业大学学报,2004,31(1):104-106.三、研究方案（主要研究内容、目标，研究方法）主要研究内容： 1.石榴叶片总RNA提取2.cDNA的合成3.克隆纤维素合成酶基因4.软籽石榴品种的纤维素合成酶基因序列分析 研究目标： 通过试验能够成功提取出RNA，并利用同源克隆方法获得纤维素合成酶基因，最终得到软籽石榴纤维素合成酶基因的全长序列。研究方法：石榴叶片总RNA提取 取石榴叶片迅速放入液氮中研磨成粉末状按照RNA提取试剂盒说明书提取石榴叶片中总RNA。cDNA的合成 利用反转录RT-PCR法合成cDNA的第一条链。纤维素合成酶基因的克隆 根据其他植物中已经注册的纤维素合成酶基因序列设计简并性引物，利用cDNA第一条链为模板进行PCR扩增，获得中间序列基因片段。 根据获得的中间序列设计引物，用RACE方法获得全长基因，并进行PCR扩增。软籽石榴品种的纤维素合成酶基因序列分析 获得的DNA片段通过DNA回收试剂盒回收，目的DNA片段与载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，进行蓝白斑筛选，提取质粒。最后送到生物公司进行测序。将获得的片段序