WHO推荐Xpert-MTB-RIF全文-20131105

1、 结核诊断和实验室服务WorldHealthOrganization参考便览简介照顾结核患者从正确诊断开始。成功的现代结核病控制策略的开展，以及对耐药和人类免疫缺陷病毒相关结核的系统性管理,其核心，是需要一个有足够生物安全、现代化的诊断方法、标准操作规程和合适质量保证的结核实验室稳健网络。可以说作为卫生系统最薄弱的环节，实验室服务历来被严重忽视，人员不足，并且资金短缺。因此诊断能力成为提升管理和控制耐药结核及人类免疫缺陷病毒（HIV）相关结核的一大瓶颈，这主要是由于：政策变化和技术转移进展缓慢，尤其是在低收入和中等收入国家；实验室改进计划不充分，资金不足；实验室基础设施和生物安全不完善；技术熟

2、练的员工数量非常欠缺；技术支持不充分。结核的实验室诊断，作为卫生系统的一项重要工作，它的加强是实验室整体水平提升的最佳手段之一。这一活动是基于国家一级的结核控制项目和公共卫生实验室服务之间的合作，在综合战略和国家实验室强化计划中，提供足够的实验室能力包括一些基本要素，保证可以同时运行。一项前所未有的致力于改善和扩大结核实验室能力的努力，目前正在进行中，由世界卫生组织和遏制结核伙伴关系的全球实验室倡议（GLI）及其国际合作者网络（ HYPERLINK /wg/gli /wg/gli）牵头。同时新的结核诊断技术的研发正在加速，并且诊断途径正在迅速发展1。基因型（分子）分析方法在扩大规划性管理和耐药

3、结核病监测中有相当大的优势，可以提供快速的诊断，标准化的测试，潜在的高通量，并且对实验室生物安全要求较低。GeneXpert平台XpertMTB/RIF试验的开发在2009年完成，它被认为是与结核斗争中的一个重要突破。这是第一次，可以把一个简单并强大的分子检测引入传统的实验室配置。这个试验能用痰标本在2小时内直接获得结果。世界卫生组织有证据确凿的数据支持广泛应用XpertMTB-RIF来诊断结核和利福平耐药结核。因此建议：1）对疑似多耐结核或HIV相关结核患者的最初诊断应采用XpertMTB/RIF试验，而不是传统的显微镜检査、培养和药敏试验（强烈推荐）；2）在多耐结核和/或HIV低发地区，X

4、pertMTB/RIF试验可作为镜检的后续试验，特别是涂片阴性的标本（非强制性建议，承认主要是资源的影响）然而，XpertMTB/RIF试验并没有替代对传统的显微镜检查、培养和药敏试验的需要，这些传统试验仍被用于监测治疗进展和检测利福平以外的药物耐药。对结核进行床旁检测可能需要等到2015年之后；因此，现有的世界卫生组织推荐的技术必须加速吸收，这需要在国家层面上对结核筛查和诊断提供足够的实验室设施和明确的政策由于实验室加强的复杂性，建议在国家层面上有专业的实验室顾问在执行过程中进行指导。在适当的实验室服务中使用的技术建立、配备和维护实验室网络是具有挑战性、复杂和昂贵的事情。如果实验室服务的所有

5、核心要素不能同时具备，那么引进新技术注定要失败。这些要素包括：实验室基础设施，适当的生物安全措施和维护；设备验证和维护；标本运输和转诊机制；实验室的物资管理；实验室信息和数据管理系统；实验室质量管理系统；适当的、充足的策略和基金用于实验室人力资源的开发。GLI已经开发出了一种在国家实验室战略计划内的，适当的实验室服务范围内，旨在确保结核诊断质量的加强结核实验室的路线图2，详见网站 HYPERLINK /tb/dots/laboratory/policy/en /tb/dots/laboratory/policy/en.实验室生物安全结核分枝杆菌是一种生物危险三级病原体，但是根据采用的检测方法不

6、同，标本处理具有不同的风险。对在结核实验室进行的不同技术程序采用以风险为基础的评估，可以使最低要求的实验室设施的发展成为可能。风险评估方法考虑到实验室的细菌负荷（标本数量，培养数量），细菌的活性，标本处理过程中是否容易产生气溶胶，使用每种技术产生感染性气溶胶的可能性，实验室的工作量，患者的流行病学特点，以及实验室工作人员的健康。相对风险总结如下：直接涂片进行抗酸染色镜检，和用XpertMTB/RIF处理样本最低要求足够的通风*；与其它区域分离的实验室；进入实验室仅限于授权人员；涂片制备的工作台与实验室其他工作台分离。*如果当地气候条件允许的情况下，可以打开窗户确保足够的通风。排气扇可用于确保足

7、够的室内换气。当气候条件不适于开窗，应考虑机械通风系统，提供一个不在房间里循环的向内流动的空气。痰标本进行初步培养接种，直接硝酸还原酶法（NRA），直接的显微观察药物敏感性法（MODS）或者直接线性探针检测（LPA）最低要求与其他区域分离的实验室；进入实验室仅限于授权人员；地板，墙壁，天花板，长椅和家具有不透水表面；窗口应永久关闭。空气供给是被动的或没有再循环；用气溶胶紧桶离心；在适当的生物安全柜（BSC）处理标本，1类（EN12469/NSF49）或类IIa2（NSF49）或II类（EN12469）配有HEPA过滤器H14；生物安全柜通过认证的制造商设计，正确安装，定期维护和至少每年现场重新

8、认证；控制通风系统保持定向气流进入实验室，从功能清洁区到污染区，至少每小时6到12次换气*。*控制通风系统的安装应与工程专家规划。利用表型的方法和/或线性探针试验进行培养鉴定和药敏试验（DST）最低要求：满足上述试验的所有要求，此外：密闭实验室，双门入口；现场和实验室附近有高压灭菌器，用于废物安全处置。适用于不同实验室服务水平的技术技术程序的专业性特点，实验室管理和实施，需要在不同水平的实验室检测中确保实验室质量，有明确的标本转诊机制。传统的结核诊断的分层实验室服务在许多资源文件中有所描述3。三个主要的实验室服务水平对大多数国家是共同的：周边水平（区级）:进行痰涂片镜检；利用XpertMTB/

9、RIF进行结核和利福平耐药检测；需要进一步检测时将标本或和病人转交于高一级水平实验室。中间水平（地区级）:进行痰涂片镜检；利用XpertMTB/RIF进行结核和利福平耐药检测；常规培养方法，有或没有菌种鉴定，一线药物敏感性试验（DST）；需要进一步检测时（如：二线药物敏感性试验）将培养标本转交于高一级水平实验室。中心水平（国家或参考实验室）:进行痰涂片镜检；利用XpertMTB/RIF进行结核和利福平耐药检测；常规和快速培养，表型药物敏感性试验和分子检测；需要进一步检测时（如二线药物敏感性试验或分子测序）将菌株转交于其他国家或地区的超国家参考实验室。世界卫生组织推荐的技术显微镜检查分枝杆菌区别

10、于其他微生物的特点是有厚的含脂质的细胞壁，尽管用含酸试剂脱色仍可保留生化染色（所谓的“抗酸性”）。优点:痰涂片镜检是简单和便宜的，可快速检测肺结核；肺结核，特别是有空洞疾病的患者的痰标本通常包含足够大量的抗酸杆菌，可通过显微镜容易的检测到。缺点：直接涂片镜检是相对不敏感的，镜检阳性需每毫升痰至少有5000个细菌。对合并HIV感染的肺外结核患者，和非结核分枝杆菌（NTM）感染患者中，涂片灵敏度进一步降低。局限性：抗酸杆菌（AFB）显微镜检查不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌（NTM），不能区分活菌死菌，也不能区分敏感与耐药菌株。传统的光学显微镜检查直接在痰标本进行萋-尼氏光学显微镜检查适用于所

11、有实验室服务水平，包括在初级卫生保健中心或地区医院的周围实验室。没有足够的证据显示预处理痰标本（如浓缩或化学处理）比直接涂片镜检提供更优异的结果。因此不推荐在项目设置中使用这些方法。萋-尼氏光学显微镜检查的数量每个检查者每天不应超过20张，因为过多会引起视觉疲劳导致的读片质量下降；另一方面，萋-尼氏光学显微镜检查读片熟练程度只能通过每周检查至少10-15个涂片来保持4。一般来说，每100,000人口设置一个萋-尼氏光学显微镜检查中心是足够的；然而，萋-尼氏光学显微镜检查服务的扩张也应该考虑到现有服务的定位和利用，城市/农村人口分布，和样品转运机制。传统的荧光显微镜检查传统的荧光显微镜通常使用石

12、英卤素灯或高压汞灯为光源。较低的物镜放大率是用来扫描涂片，允许一个更大区域的涂片可见，因此比萋-尼氏光学显微镜检查用时更少。传统的荧光显微镜平均比萋-尼氏光学显微镜敏感10%，但需要熟练的技术知识。资金和运营成本也相对更高。因此世界卫生组织推荐在每天超过100个涂片的中间水平实验室采用传统的荧光显微镜检查方法5。发光二极管Ced）荧光显微镜LED技术的出现使荧光显微镜可以使用更便宜的光源LED显微镜或附件需要较少的功率,能够在电池上运行，灯泡有一个很长的半衰期，并且破损后不会释放潜在的有害物质。最近世界卫生组织的评估确定LED显微镜相比传统的荧光显微镜具有诊断准确性，并且比传统的萋-尼氏光学显

13、微镜效率更高。因此建议LED显微镜可以替代常规荧光显微镜，并且在高和低容量的实验室LED显微镜可以阶段性的替代传统的萋-尼氏光学显微镜6。培养和菌种鉴定优点：结核分枝杆菌的培养和鉴定提供了确诊结核的依据，显著的增加了病例数的发现（通常30%至50%）,并且可以更早的发现病例（通常在他们具有传染性以前）。培养也可以提供必要的菌株进行常规药敏试验。缺点:培养比显微镜检查更复杂和昂贵，需要培养基制备、标本处理，和微生物生长的设施，特定的实验室设备，熟练的技术人员，和适当的生物安全条件。局限性:标本在培养前需要净化来减少其它微生物的过量生长。所有的净化方法在一定程度上都对分枝杆菌有害，因此培养不是10

14、0%敏感。良好的实验室实践可保持分枝杆菌和其它污染的微生物之间的平衡。固体和液体培养方法适用于中心/国家参考实验室（或在大型国家区域实验室）。通常，一个培养实验室足以覆盖50万到100万的人口。固体培养方法比液体培养系统更便宜，但由于分枝杆菌生长缓慢结果总是延迟。液体培养比固体培养基多报告10%病例，并且自动化系统可以提前数天报告（不是几周）。然而，液体系统更容易受到污染，并且大量的感染性材料的操作需要适当的授权和足够的安全措施。阳性的培养应可以区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌在艾滋病病毒感染者中常见，并且患病率因国家而异。对非结核分枝杆菌的治疗方法与结核和耐药结核完全不同。作

15、为最低要求，进行药物敏感试验的实验室必须能区分结核分枝杆菌与其他非结核分枝杆菌（进一步的分型在战略性计划中没有推荐）。通常结合培养生长的生物学特性和选定的分子或生化试验（不确定性会延迟最终结果报告）用来进行确认7。推荐的培养菌株的快速免疫层析试验（所谓的带形态试验）鉴定能在15分钟内提供一个明确的鉴定结核分枝杆菌的结果8。分子检测，生化法和带形态试验适合进行培养和药敏试验的实验室。药物敏感性试验优点：药物敏感性试验提供了耐药结核分枝杆菌的明确诊断。有许多不同的药物敏感试验:表型的方法包括在抗结核药物的存在下检测结核分枝杆菌的生长（指示耐药性）或生长抑制（表示药物敏感性）。基因型的方法是针对特定

16、的耐个别药物的分子突变。表型药物敏感性试验是在固体或液体培养基中进行的直接或间接的试验。直接测试,是一组含有药物和不含药物的培养基中直接接种浓缩后的样品。间接测试包括从原始标本中得到的纯培养物接种到含药物的培养基。间接表型试验已被广泛验证，是目前被视为金标准。常用的三种方法：比例法，绝对浓度法，和耐药倍数法。对一线抗结核药物,这三种药物敏感性试验结果没有明显差异。缺点：考虑到适当的实验室基础设施的需求（特别是生物安全）和现有的技术/方法的技术复杂性，药物敏感性试验仅适用于中央/国家参考实验室水平。局限性：药物敏感性试验的准确度因检测药物不同而变化（见下文）。对一线和二线的药物敏感性试验，推荐与

17、一个超国家参考实验室（SRL）网络有正式的联系，确保专家参与到实验室设计，标本和运送流程，生物安全，标准操作规程，设备维护和外部质量保证。一线药物敏感性试验利福平和异烟肼的药物敏感性试验最准确，对链霉素、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的药物敏感性试验的可靠性和可重复性较差。作为最低要求，治疗多重耐药结核患者的国家结核控制项目应建立可检测多重耐药结核的实验室检测能力。在高负担地区，利福平耐药是一个有效的和可靠的多重耐药结核的指标。快速药物敏感性测试对于鉴别有多耐结核风险的患者必不可少，应为第一优先。对一线药物敏感性试验的自动化液体系统和分子线性探针检测（见后）被推荐为目前的金标准。XpertMTB/RIF试

18、验被推荐作为对有多耐结核风险患者的独立的诊断测试（见下文）。一旦多重耐药结核分枝杆菌得到证实，需要根据目前世界卫生组织的建议分析其他的一线和二线药物的药敏结果9。二线药物敏感性试验二线药物敏感性试验是复杂和昂贵的。商品化液相法和固体培养基的比例方法已经进行了研究；固体培养基上进行绝对浓度或耐药比例的方法还没有被验证。二线药物敏感性试验的自动化液体系统被推荐为目前的金标准。除非在实验室所需的基础设施和能力已经建立，严格的质量保证已到位，可持续的熟练程度已被证明的条件下，常规的二线药物敏感性试验是不推荐的。为了保持熟练程度和专业知识，只有在每年预计来源高危患者的样本至少有200个时，才建议进行二线

19、药物敏感性试验。氨基糖苷类、多肽和氟喹诺酮类药物的药物敏感性试验已被证明具有较好的可靠性和重复性是确保多重耐药结核诊断的质量保证。由于不能保证实验室测试的可靠性和可重复性，对其他的二线药物进行常规药物敏感性试验（乙硫异烟胺，丙硫异烟胺，环丝氨酸，苯环丝氨酸，对氨基水杨酸，氯法齐明，克拉霉素，阿莫西林-克拉维酸，利奈唑胺）是不推荐的。利用非商品化的方法进行药物敏感性试验非商品化的培养和药物敏感性试验方法比商品化系统便宜；然而，由于方法学上缺乏标准化和局部变化，非商品化的方法容易出现错误。这些方法的性能是高度取决于操作者和良好实验室规范，良好的微生物技术，和足够的质量保证，因此有必要进行适当的培训

20、支持。作为商品化系统，必须实施和执行严格的实验室协议，标准操作程序，和内部质量控制机制。选择非商品化培养和药物敏感试验的证据基础，已由世界卫生组织审查。在选定地区的参考/国家实验室，在严格的实验室程序下，这些方法的性能是可接受的io。这些方法包括显微观察药物敏感性法（MODS），氧化还原指示剂比色法（CRI）和硝酸还原酶法（NRA）。他们各自的使用建议：显微观察药物敏感性法:液体培养菌落的方法，基于接种标本到无药物和有药物的培养基，然后用显微镜检查早期生长；-推荐作为直接或间接的检测，对疑似多重耐药结核患者进行快速筛选：氧化还原指示剂比色法:基于颜色减少的间接测试方法,结核杆菌体外暴露抗结核药

21、物后，彩色指示剂加入微量滴定板的液体培养基中；-建议作为疑似多重耐药结核病人分离的结核分枝杆菌的间接检测，并确认检测多重耐药结核是比使用商品化液体培养进行传统药敏试验或分子线性探针（见下文）的方法检测时间更慢（但更便宜）；硝酸还原酶法:基于结核杆菌减少硝酸盐的能力，在固体培养基上的直接和/或间接的方法,通过显色反应检测；-推荐作为直接或间接的检测，对疑似多重耐药结核病人筛选，并确认多重耐药结核检测间接应用方法并不比使用固体培养基进行传统药敏试验的方法（见下文）更快。商业和非商业培养和药物敏感性试验系统/方法只适合在中央/国家参考实验室水平执行。分子检测最终的目标应该是实现分子检测（如线性探针检

22、测、XpertMTB/RIF试验或将来世界卫生组织批准的其他分子平台）成为多耐结核或HIV相关结核的快速鉴定第一步。分子线性探针试验（LPA,如HAIN）集中在利福平耐药性的快速检测（单独或联合异烟肼耐药），2008年已被世界卫生组织推荐，对它的使用在国家层面有详细的政策指导11。XpertMTB/RIF试验于2010年12月由世界卫生组织推荐12,有描述快速应用和操作指引的支持文件13。优点：基因型的方法在扩大耐药结核病和HIV相关结核的项目管理中有相当大的优势，特别是考虑到速度，标准化测试，潜在的高通量，并降低生物安全需求。XpertMTB/RIF试验可以在一个测试中同时检测结核和利福平耐

23、药。在高负担地区，利福平耐药是多重耐药结核的一个很好和可靠的替代指标。XpertMTB/RIF试验适用于各级实验室，但一台设备（GX-2）每天只能做20个标本。更多标本的地区可能需要一台以上的装置。XpertMTB/RIF试验可作为有多耐结核风险患者的一个独立的诊断检测。缺点：分子线性探针试验不能取代传统培养和药物敏感性试验。目前可用的分子线性探针试验仅注册适用于涂片阳性的痰标本和常规培养方法培养出的痰涂片阴性的菌株。局限性：分子线性探针试验适合于在中央/国家参考实验室水平执行，如果适当的基础设施可以保证，也可能在低一级的区域执行。传统培养（固体或液体）是用来监测耐药结核患者的治疗反应（培养转

24、换）。XpertMTB/RIF试验需要连续和稳定的电力供应和试剂盒模块的年度校准。在利福平耐药罕见的区域，XpertMTB/RIF试验对阳性预测值的设置很低，并且结果需要由表型药物敏感性试验或分子线性探针试验确证。选择合适的策略和技术/方法1目前可用的技术并不是相互排斥的。分子线性探针检测和选定的非商品化培养和药物敏感性试验方法仅直接用于痰涂片阳性的标本。涂片阴性的标本仍需要传统培养，传统表型药物敏感性试验需要用来检测广泛耐药结核；2液体培养和分子线性探针检测作为国际金标准，可以阶段性引入，不用放弃现有固体培养和药物敏感性试验；3XpertMTB/RIF试验适用于区级和地区级水平的使用，也可用

25、于各级实验室。XpertMTB/RIF试验的半定量结果可更好地获得应用14。传统培养(固体或液体)用来监测耐药结核患者的治疗反应(如培养转换和治疗结果)。4快速的表型药物敏感性试验方法提出了一个临时的解决方案，特别是在资源有限的地区，而基因型检测能力正在开发；5结核的新技术/方法的实施应当由卫生部在加强实验室计划的国家战略中决定，需要实验室的专家参与；6结核的诊断能力，应与药物和规划能力相联系，以确保患者在适当的护理标准下进行治疗。参考文献：1.世界卫生组织,遏制结核病伙伴关系重组特别小组,遏制结核病伙伴关系新的诊断工作组.结核病控制的新的实验室诊断工具2009年.参见hTTp:/www.sT

26、opTB.org/reTooLiNg.2世界卫生组织全球实验室倡议。加强结核实验室的路线图010年.参见:HTTp:www.sTopTB.ORg/wg/G.3世界卫生组织.结核控制的实验室服务,第I部分:组织和管理.日内瓦,WHO,1998(WHO/TB/98.258).参见hTTp:/www.whQ.iNT/TB/dQTs/lABQRATQry/resQurces).4世界卫生组织.结核控制的实验室服务，第II部分：显微镜检查.日内瓦，世界卫生组织，1998(WHO/TB/98.258).参见hTTp:/www.who.inT/Th/doTs/lahoraTory/resources).世界

27、卫生组织.结核控制的实验室服务，第II部分:显微镜检查.日内瓦，世界卫生组织，1998(WHO/TB/98.258).参见 HYPERLINK http:/www.who.iNt/tB/Dots/lABorAtory/resources http:/www.who.iNt/tB/Dots/lABorAtory/resources).世界卫生组织.荧光发光二极管显微镜在诊断结核中的政策声明，2010年.参见: HYPERLINK http:/www.who.lNt/tb/Dots/Iaboratory/poIIcy/eNG http:/www.who.lNt/tb/Dots/Iaboratory/poIIcy/eNG);7世界卫生组织.结核控制的实验室服务.第III部分：培养.日内瓦，世界卫生组织,1998年(WHO/TB/98.258.参见 HYPERLINK http:/www.who.lNt/tb/D