生化分离技术

1、生化(shn hu)分离工程第二章 生化分离(fnl)技术共三十六页破碎(p su)缓冲液一般为0.1-0.2mol/L，pH为78的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液（与细胞(xbo)内环境相似）抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH （还原型）酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etcPVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）共三十六页 细胞(xbo)破碎（Cell disrupt

2、ion）细胞的结构动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁坚固Why？较难破碎。酵母或其他真菌(zhnjn)：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚共三十六页G+：典型(dinxng)金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同类型细菌的细胞壁结构成分：细胞壁组成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0类脂质一般无约20%蛋白质0较高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治”结构(jigu)，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度共三十六页4.1 细胞破碎(

3、p su)技术细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中(qzhng)的目标产物机械法非机械法珠磨法、压榨法高压匀浆、超声破碎、撞击法固体剪切作用液体剪切作用1）酶溶法2）化学法3）物理法干燥处理溶胞作用超临界细胞破碎共三十六页1、机械(jxi)方法破碎1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速(o s)搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物可采用间歇式或连续操作珠磨机增加装珠量、延长破碎时间、提高转速等手段可提高破碎率总能耗增加且须注意换热适用于多数微生物细胞，esp.

4、有大量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞共三十六页2）高压(goy)匀浆法（ high-pressure homogenization ）破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的环隙高速(o s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速(o s)撞击后，急剧释放到低压环境破碎作用力：突然减压和高速冲撞阀座阀撞击环操作参数少且易于确定，实验室及工业生产中均可适用于酵母和多数细胞的破碎对易造成堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不适用共三十六页3）超声波破碎(p su)（ultrasonication）机理(j l)：高于20kH

5、z的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。缺点：A、影响因素多，细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温；D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。共三十六页机械(jxi)破碎法总结以上几种(j zhn)机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验室或工业用）方法珠磨高压匀浆超声破碎使用规模实验室、工业用实验室、工业用实验室适用对象酵母、藻类及丝状真菌酵母菌、细菌细菌共三十六页2、细胞物理破碎(p su)方法1）渗透压冲击法（osmotic sho

6、ck）最为温和(wnh)的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂2）冻结融化法（Freezing and Thawing）细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效共三十六页3、化学法破碎(p su)用某些(mu xi)化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些(mu xi)组分酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来化学渗透法利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；

7、表面活性剂十二烷基磺酸钠、Triton X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、价格昂贵，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需与机械法连用。共三十六页4、生物(shngw)法破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大(zn d)胞内产物的通透性溶菌酶lysozyme适用于G的细胞壁，若配合EDTA、TritonX-100则可有效作用于G的胞壁；真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶优点：产品释放的选

8、择性高、产品破坏少、对温度及pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细胞壁结构决定了需要不同的酶共三十六页4、生物(shngw)法破碎自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生(chnshng)溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，esp.G-的酶溶更受到了限制共三十六页5、超临界细胞(xbo)破碎技术超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有类似于气体(qt)的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具有较好的流动性能、传质性能和溶解性能利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突然降压后，因细

9、胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生破裂可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果共三十六页破碎(p su)方法的选择选择的一般原则A、提取产物(chnw)在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎过程中应注意的问题A、多种破碎方法相结合可产生很大优势B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物共三十六页 沉淀分离法： 通过调整溶液的理化参数来改变溶剂和溶质的能量平衡，产生沉淀，从而

10、(cng r)将生化成分从溶液中分离。 具有浓缩和分离的双重作用。 在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。共三十六页盐析沉淀法有机溶剂沉淀(chndin)等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法共三十六页 二、盐析(yn x)沉淀法 盐析法： 在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，目前该方法仍广泛用来(yn li)回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质。共三十六页共三十六页 （一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成(z chn)、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可

11、利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。共三十六页 蛋白质在自然环境(z rn hun jn)中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团蛋白质呈稳定(wndng)的分散状态两性物质，一定pH下表面带有一定的电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。共三十六页 当向蛋白质溶液(rngy)中加入中性盐时：低盐-盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度(qingd)的增加，蛋白质溶解度增大)高盐-盐析

12、(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域共三十六页 蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关(yugun)，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。共三十六页 （三）影响(yngxing)盐析的各种因素 无机盐的加入量蛋白质的浓度温度(wnd)pH操作方式共三十六页 6.盐析(yn x)法的优缺点（1）优点(yudin)： 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活； 非蛋白的杂质

13、很少被夹带沉淀； 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。共三十六页 （2）缺点： 沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生(chnshng)氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上 盐析法可以作为(zuwi)初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。共三十六页 二、有机溶剂沉淀法 在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度(nngd)不同，因此调节有机溶剂的浓度(nngd)，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达

14、到分离纯化的目的。 不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。共三十六页 常用于生物(shngw)大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的共三十六页 （二）影响沉淀(chndin)效果的因素 温度(wnd)pH浓度蛋白质浓度共三十六页5.有机溶剂沉淀法的优缺点（1）优点： 乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）； 有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离(fnl)容易，适于用离心分离(fnl)收集沉淀物。共三十六页（2）缺点： 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限； 采用大

15、量有机溶剂，成本较高。 为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。 有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备(shbi)都应有防护措施。共三十六页 1.等电点沉淀法 两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集(jj)，发生沉淀。 不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。共三十六页H+OH-+pHpI,带负电，有水膜，是稳定的亲水胶体_+_pH=pI时, 有水膜，是不稳定的亲水胶体中性盐破坏水膜+中性盐破坏(phui)水膜_+_中性盐破坏水膜_中性盐中

16、和电荷SO42-中性盐中和电荷NH4+或Na+蛋白质的盐析(yn x)机制示意图蛋白质沉淀共三十六页 只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。 对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物(shngw)分子的pI很接近，因此很少单独使用。 往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。 采用该法时必须注意： 溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。共三十六页 等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。 如在工业上生产胰岛素时： 先调pH至8.0去除碱性(jin xn)杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。共三十六页内容摘要生化分离工程。一般为0.1-0.2mol/L，pH为78的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液（与细胞内环境相似）。PVP：植物组织