液相色谱培训讲义课件

1、液相色谱培训讲义北京东西分析仪器有限公司主要内容高效液相色谱的基础知识高效液相色谱系统固定相和流动相LC-5500的使用、维护及应用液相色谱分析中的样品前处理高效液相色谱的基础知识液相色谱培训（一）色谱色谱法 又叫色层法、层析法，其本质是一种分离分析方法 色谱法是利用混合物中各组分在两相间分布系数的差异，在两相相对移动过程中，各物质在两相间反复多次分配，从而使各组分得到分离的方法色谱 目前最有效的分离方法色谱的分类按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为

2、流动相(又叫洗脱剂)液相色谱发展简史1903年：俄国植物学家Tswett提出了应用吸附学原理分离植物色素的新方法，标志这现代色谱学的开始1931年：Kuhn等以粉碎的碳酸钙装填色谱柱，成功地从蛋黄中分离出植物叶黄素，也证实了色谱法可以用于制备分离1941年：Martin等采用水分饱和的硅胶为固定相，以含乙醇的氯仿为流动相，分离了乙酰基氨基酸，这是分配色谱的首次应用20世纪60年代：高效液相色谱得到普及应用1975年：美国Dow Chemical公司Small等研制成功了采用电导检测器的高效液相色谱仪，这种方法称为离子色谱法（IC），扩展了高效液相色谱的领域。近年来：超高压液相色谱（UPLC）问

3、世，使得液相色谱应用领域更加广泛茨维特实验的原形1903年Tswett用右边图示的实验装置，使用液体淋洗的办法实现了多种物质的分离从而确立了色谱分析法。从此这个实验方法就成为： 经典液相色谱法 时至今日这种方法还被广泛地应用着随着科学技术的发展，科学工作者改进了液相色谱柱的填料，从而就出现了高效液相色谱分析。几种英文缩写的解释：HPLCHigh Performance Liquid ChromatographyHPLCHigh Pressure Liquid Chromatography高效液相色谱 HPLC (High Performance Liquid Chromatography )以

4、气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段： o高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器 广泛应用于各个领域: o医药，环保，石化，生命科学，食品工业，农业HPLC的分离原理高效液相色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。流动相色谱分离样品的过程HPLC的特点“三高” “一快” “一广”高柱效高灵敏度高选择

5、性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别分析对象 GC：可分析能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 HPLC：可分析溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性 和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性 差及高分子和离子型样品均可检测流动相 GC：流动相为气体 HPLC：流动相为液体 HPLC与经典LC区别经典LCHPLC色谱柱：柱长10200cm，内径1050mm色谱柱：柱长1025cm，内径210mm常压或减压高压，4050MPa填料颗粒大，75600m（20030目）填料颗粒小，25

6、0m（2500300目）柱效低，2050块/m柱效高，4000060000块/m分析速度慢，120h分析速度快，0.051.0h色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测基本概念和术语色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基线信号的波动。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线

7、。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。检测器响应保留时间和峰形检测器响应保留时间和峰形检测器响应保留时间和峰形色谱图基底基线色谱峰峰面积峰高拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。峰底基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height，h)-峰的

8、最高点至峰底的距离。标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线x1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与峰底的两个交点间的距离。W4半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/22.355峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。基本概念和术语基本概念和术语定性参数（保留值）死时间(dead time，t0)

9、-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流通池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流通池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速）保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后出现浓

10、度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR柱效参数理论塔板数(theoretical plate number，N)-用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以

11、上。）若用调整保留时间(tR)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。理论塔板高度(theoretical plate height，H)-每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。基本概念和术语基本概念和术语相平衡参数分配系数(distribution coefficient，K)-在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。即， K = Cs / Cm 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)， 凝胶色

12、谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的

13、前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。基本概念和术语容量因子(capacity factor，k)-化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（tR）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时， 化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留， tR 0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性

14、质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR 、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。选择性因子(selectivity factor，)-相邻两组分的分配系数或容量因子之比。又称为相对保留时间（美国药典）。 要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。基本概念和术语分离参数分离度(resolution，R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的

15、分离程度。当W1W2时，R1。当R1时，称为4分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R1.5时，称为6分离，裸露峰面积为99.7%。R1.5称为完全分离。 中国药典规定R应大于1.5。 提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，R0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值； b. 改变柱温； c. 改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k趋于0时，R也趋于0；

16、k增大，R也增大。但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k在110范围内，最好为25，窄径柱可更小些。R = 1R = 1.5色谱分离的理论 色谱理论有平衡色谱理论；塔板理论；速率理论等理论。下面对塔板理论和速率理论作简单的介绍。塔板理论(Tower plank Theories)塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为： 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达

17、到分配平衡。 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。 理论塔板数 色谱柱效能 描述当溶质流经色谱柱时谱带展宽速率理论塔板等效高度有效理论塔板数塔板理论(Tower plank Theories)速率理论(Velocity Theories)1956年荷兰学者Van De

18、emter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响 速率理论(Velocity Theories)H = A + B/u + Cgu + CluHuB/uCuAu最佳A涡流扩散项B分子扩散项Cg固定相传质阻抗Cl流动相传质阻抗高效液相色谱的分类按色谱过程的分离机制，可将高效液相色谱分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱和体积排阻色谱等类别根据流动相与固定相极性的差别，可分为正相色谱和反相色谱两种模式。固定相极性大于流动相极性时，称为正相色谱（N

19、P）；反之，称为反相色谱（RP）正相高效液相色谱以极性的亲水性填料作固定相（如羟基柱、氨基柱、氰基柱），以非极性的疏水性溶剂或混合物作流动相（如己烷）的高效液相色谱正相高效液相色谱的流动相：常用己烷，环己烷作基础溶剂，加二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃调节极性应用于分离中等极性和极性较强的化合物，如甾醇类、类脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其它有机物反相高效液相色谱以强疏水性的填料作固定相（如硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相），以可以和水混溶的有机溶剂做流动相（如甲醇、乙腈）的高效液相色谱反相高效液相色谱的流动相：高纯度的水，甲醇，乙腈，一定pH值的缓冲液应用十分广泛，占高效液相色谱的70%

20、80%，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白质（50kD）的分析均可应用高效液相色谱流程图高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱储液瓶色谱分离样品的过程色 谱 柱检测器色 谱 图时刻A时刻B时刻C时刻D时刻E时刻F进样色谱图的作用 说明样品中的组分数 根据保留时间值定性 根据峰面积（峰高）定量 评价柱效及分离情况定性和定量方法死时间t0，保留时间tR峰高h，峰面积A基线峰底色谱峰峰高峰面积利用保留值定性在液相色谱中，组分的保留行为不仅与固定相有关，还与流动相的种类、组成有关在液相色谱中主要是用与已知物对照的方法定性，改变条件进一步判断利用文献数据只能作为参考利用

21、三维图谱进行定性，可靠性大大增加用保留时间定性的谱图对比三聚氰胺标样蛋白粉样品定量方法峰高和峰面积法定量，主要有四种定量方法 归一化法 内标法 外标法-标准曲线法 内加法外标法液相最常用的定量方法峰高法和峰面积法的选择主要决定于检测器的线性范围、峰高和峰面积测量的准确性和重复性。归一化法最好用峰面积法，其余方法峰高和峰面积都可使用分离度较好，色谱峰形较好，峰面积可以准确测量时，用峰面积定量为好，特别是HPLC使用多元梯度时，最好用峰面积定量分离度不好、色谱峰形不好时，用峰高法为好保留时间短的用峰高法，长的用峰面积法高效液相色谱系统液相色谱培训（二）高效液相色谱流程图高压泵进样器检测器色谱工作站

22、色谱柱储液瓶一个存放流动相的容器。其结构材料必须对流动相是化学惰性的，常用的溶剂储液瓶的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料、特种塑料聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯衬里不锈钢容器等，贮液罐容积一般为0.52 L 储液瓶输液系统功能：溶剂输送目标：稳定准确重要指标：耐压能力压力脉动流量精密度流量准确性高压输液泵柱双柱塞往复式并联泵柱双柱塞往复式串联泵进样器自动进样器和手动进样器原理：六通阀手动进样器六通阀一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。耐高压（3540MPa），进样量准确，重复性

23、好，操作方便 分离系统功能：组分分离目标：分辨力强效率高色谱柱液相色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，是分析好坏、成败的关键键合相色谱柱键合相:反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅胶、 -NH2、 -CN、-OH其它 (手性柱, 离子交换柱): 10%反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。C18 和 C8 在反相色谱中应用得最为广泛。检测器功能：检测组分浓度目标：准确检出限低重要指标：噪声、漂移、线性、检出限紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器示差折光检测器电导检测器蒸发光散射检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选

24、择性吸收定量基础：朗伯-比耳定律，ACL优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器 样品池二极管阵列光栅D2 / W 灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器二极管阵列检测器1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器的优点大多数有机化合物有一定程度的吸光度，所以紫外-可见检测器可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器 -多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（其中50%以上是紫外-可见检测器，25%是PDA）紫外-可见检测器原理：基于被分析组

25、分发射的荧光强度进行检测优点： 1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一 2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）荧光检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器，缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3）属于中等灵敏度的检测器示差折光检测器原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱缺点：对温度变化敏感（每升高1

26、度，电导率增加2%-2.5%)主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子电导检测器蒸发激光光散射检测器（ELSD）通用型检测器（适合于挥发性比流动相低的任何组分）；响应值与组分质量有关；可用于梯度洗脱HPLC柱喷雾气体蒸发漂移管激光光源样品液滴光二极管检测器散射室工作站数据采集系统功能：采集处理数据目标：使用便捷功能完善梯度洗脱HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式 等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差

27、异较大的复杂样品 比例阀检测器进样器ABCD色谱柱高压输液泵低压梯度阻尼器混合器高压输液泵检测器进样器色谱柱梯度混合器高压输液泵高压梯度梯度洗脱梯度洗脱的特点优点缩短分析时间增加分离能力提高检测灵敏度缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重复性较低高效液相色谱的配件管路与连接件脱气装置：在线脱气机或超声波清洗器过滤器：溶剂过滤器和针筒式过滤器进样器：平头进样器不同材质的管路不锈钢管：耐腐蚀性好，有精密的同轴度，一般用于高压部分聚合物管：用在液相色谱系统中从储液瓶到泵、检测器出口以后和进样器排液口等低压部分PEEK（聚醚醚酮）管：是一种耐高温、高性能的工程塑料，具有良

28、好的惰性，适宜于生物样品的分离分析液路连接件连接件也称接头一般可分为两种：高压接头和低压接头 高压接头采用不锈钢材质 低压接头采用高聚物材质连接件主要有卡套和空心螺钉液路连接密封示意图 液路连接装配不合适的示意图脱气装置超声波清洗器通过超声波作用使流动相中的气泡排除，超声脱气效率只有2030左右在线脱气机脱气效果好，脱气效率大于70，在线脱气机使用方便、省事，尤其是在作梯度洗脱时最好用在线脱气机。过滤装置溶剂过滤器为了除去流动相中的杂质，对流动相进行过滤溶剂过滤器要配滤膜（有机系和水系，规格0.45m或更小孔径的滤膜）针筒式过滤器样品溶液在进入色谱系统前必须经过针筒式过滤器针筒式过滤器也分为有

29、机系和水系，规格0.45m或更小孔径的进样器液相色谱的进样器必须是平头进样器常配的进样器规格为10、25、50、100 L最常使用的为50 L的进样器LC-5500和LC-5510高效液相色谱仪介绍LC-5500高效液相色谱仪LC-5500高压输液泵P-101型高压液相平流泵由泵体、过滤器、缓冲器、步进电机、步进电机驱动器、控制电路板、键盘以及液晶显示器等部件构成 LC-5500高压输液泵技术指标工作压力：040MPa流量范围：0.015.0mL/min流量稳定性：1压力脉动： 1LC-5500高压输液泵主要特点采用双柱塞交替输液吸液，特殊设计的非圆凸轮运动曲线，保证输出液体流速稳定精密电机及

30、电路设计，实现流量控制和流速的稳定性压力传感器避免了过压对色谱柱和泵的意外损害性能良好的阻尼器有效消除了输液脉冲采用LCD带背光的显示屏来显示泵的设置参数和运行参数。梯度洗脱流量程序智能化，流量准确LC-5500高效液相色谱仪主机主机包括两部分：柱温箱紫外-可见光检测器LC-5500柱温箱技术指标：温度控制范围：室温1080温度控制精度：1功能特点：控温精度准确更换色谱柱方便分析结果重现性好保证检测稳定性LC-5500紫外-可见光检测器技术指标：波长范围：190650nm波长精度: 2nm 波长重复性:优于2nm基线噪声：110-4AU基线漂移：510-4AU/h光谱带宽：8nm流通池体积：5

31、ul最小检测浓度：410-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5500紫外-可见光检测器功能特点：使用波长范围宽波长精度准确能够实现多波长测定LC-5500工作站功能特点：具有仪器控制系统、数据采集和处理系统；可进行波长程序控制可设定柱温可对两台泵进行程序控制，进行梯度洗脱 LC-5510高效液相色谱仪LC-5510 在线脱气机在线脱气机主要由真空泵、脱气膜管、传感器、控制电路、真空腔等组成在线脱气机的主要目的是脱除流动相中的气泡LC-5510高压输液泵技术指标工作压力：042MPa流量范围：0.015.0mL/min流量稳定性：1压力脉动： 1LC-5100高压输液泵主要特点采用双柱塞交替输

32、液吸液，特殊设计的非圆凸轮运动曲线，保证输出液体流速稳定精密电机及电路设计，实现流量控制和流速的稳定性压力传感器避免了过压对色谱柱和泵的意外损害性能良好的阻尼器有效消除了输液脉冲采用LCD带背光的显示屏来显示泵的设置参数和运行参数。梯度洗脱流量程序智能化，流量准确LC-5510柱温箱技术指标：温度控制范围：580温度控制精度：0.2温度设定值误差： 0.5LC-5510柱温箱功能特点：控温精度准确分析结果重现性好保证检测稳定性采用LCD带背光的显示屏来显示柱温的设置和运行温度既可升温也可降温，能满足一些特殊用户的需求LC-5510紫外-可见光检测器技术指标：波长范围：190650nm波长精度:

33、 0.2nm 波长重复性:优于0.2nm基线噪声：610-5AU（动态，254nm）基线漂移：2.510-4AU/h（动态，254nm）光谱带宽：8nm流通池体积：5ul最小检测浓度：110-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5510紫外-可见光检测器功能特点：使用波长范围宽波长精度高噪声低漂移小可用汞灯自动校正波长采用LCD带背光的显示屏来显示波长的设置参数和运行参数LC-5510工作站功能特点：具有色谱仪控制系统、数据采集和处理系统；可进行波长程序控制可对两台泵进行程序控制，进行梯度洗脱功能健全，操作便捷 固定相和流动相液相色谱培训（三）色谱柱色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，要求分离度

34、高，柱容量大，分析速度快。高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、填装和使用技术等有关。液相色谱柱是分析好坏、成败的关键，整个液相分析过程中，其作用的重要性犹如人的心脏色谱柱的分类按填料表面改性与否分为吸附型和化学键合型按照分离模式分为正相、反相、离子交换、疏水作用、体积排组、亲和、手性等类型按照分离规模及色谱柱的几何尺寸，可分为制备柱、分析柱、微型柱等类型色谱柱结构色谱柱的基质填料硅胶基质填料聚合物基质填料硅胶基质填料目前应用最为广泛的基质填料高机械强度和高的比表面积可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求重现性好pH 适用范围为pH 28具

35、有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基聚合物基质填料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 稳定性好：pH 113可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩分离效率相对硅胶而言比较低重现性不好化学键合固定相将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性由化学键合固定相制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的

36、有机化合物都呈现良好的选择性，并可用于梯度洗脱操作 类 型性 质色谱分离方式应 用 范 围烷基非极性反相、离子对中等极性化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷酸、极性合成药物等苯基非极性反相、离子对非极性至中等极性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生花氨基酸酚基弱极性反相中等极性化合物，保留极性相似于C8固定相，但对多环芳烃、极性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的选择性醚基弱极性反相或正相醚基具有斥电子基团，适用于分离酚类、芳硝基化合物，其保留行为比C18更强（k增大）二醇基弱极性正相

37、或反相二醇基团比未改性的硅胶具有更弱的极性，易用水润湿，适于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离肽、蛋白质的凝胶过滤色谱固定相芳硝基弱极性正相或反相分离具有双键的化合物，如芳香族化合物多环芳烃腈基极性正相（反相）正相相似于硅胶吸附剂，为氢键接受体，适于分析极性化合物，溶质保留值比硅胶柱低，反相可提供与C8、C18，苯基柱不同的选择性胺基极性正相（反相、阴离子交换正相可分离极性化合物，如芳胺取代物，脂类，甾类化合物，氯代农药；反相分离单糖、双糖等碳水化合物；阴离子交换可分离酚、有机羧酸和核苷酸二甲胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离弱有机酸二胺基极性正相、阴离子交换

38、正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离有机酸化学键合固定相的类型及其应用范围类 型性 质色谱分离方式应 用 范 围烷基非极性反相、离子对中等极性化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷酸、极性合成药物等苯基非极性反相、离子对非极性至中等极性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生化氨基酸酚基弱极性反相中等极性化合物，保留极性相似于C8固定相，但对多环芳烃、极性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的选择性醚基弱极性反相或正相醚基具有斥电子基团，适用于分离酚类、芳硝基化合物，其保留行为比C18

39、更强（k增大）二醇基弱极性正相或反相二醇基团比未改性的硅胶具有更弱的极性，易用水润湿，适于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离肽、蛋白质的凝胶过滤色谱固定相芳硝基弱极性正相或反相分离具有双键的化合物，如芳香族化合物多环芳烃腈基极性正相（反相）正相相似于硅胶吸附剂，为氢键接受体，适于分析极性化合物，溶质保留值比硅胶柱低，反相可提供与C8、C18，苯基柱不同的选择性胺基极性正相（反相、阴离子交换正相可分离极性化合物，如芳胺取代物，脂类，甾类化合物，氯代农药；反相分离单糖、双糖等碳水化合物；阴离子交换可分离酚、有机羧酸和核苷酸二甲胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离弱有

40、机酸二胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离有机酸 使用键合固定相应注意的问题（1）硅胶键合相的稳定性 键合相的使用寿命取决于键合的有机官能团在硅胶表面的覆盖程度，覆盖量大或呈多分子 覆盖层时会增加其稳定性。通常正相键合相的稳定性要低于反相键合相反相烷基键合相的 稳定性与使用流动相的pH值有关，通常水溶液的pH应保持在28之间，pH8.5会引起基 体硅胶的溶解。（2）键合相色谱分离的重现性 使用键合相时经常会遇到，同一类型的键合相，因生产厂家不同，或生产批号不同，而表 现出不同的色谱分离特性，为此应在实验室中准备一定数量相同批号的键合固定相（或色 谱柱），以保证分

41、析结果有良好的重现性。（3）键合相色谱分离的选择性 在反相色谱分析中，使用同一种ODS固定相，并用两种极性参数值相近，但由不同溶剂 组成的流动相时，会由于“溶剂诱导选择性的变化”而获得不同的结果。（4）键合相的再生 使用键合相色谱柱时，由于大量极性或非极性样品的连续注入，会引起固定相对样品的吸 附、缔合等不良效应，而使柱分离性能变差，引起峰形变宽或拖尾等现像此时应及时对色 谱柱进行再生处理。对正相键合相柱可用11甲醇氯仿流动相来进行再生；对反相键合 相柱可用甲醇流动相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或约0.01mol/L无机酸水 溶液进行再生。正相色谱固定相最常用的正相色谱固定相硅胶最

42、常用的极性键合固定相氰基（CN）、氨基（NH2）等反相色谱固定相大多数是各种烃基硅烷的键合硅胶：如C2、C4、C6、C8、C16、C18和C22等 最常用的是C18，又称ODS，即十八烷基硅烷键合硅胶测柱效-良好的色谱实验习惯 评价色谱柱好坏的标准 1）理论塔板数N 2）拖尾因子Tf 3）色谱柱背压 4）pH值的适用范围 5）使用寿命理论塔板数 N粒径 (m)柱长 (cm)塔 板 数 N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00

43、031012,000-14,00031517,000-20,000拖尾因子TfAs = 1.0-1.05 很 好As = 1.2 一 般As = 2 差As = 4 很差不对称因子和拖尾因子的关系As (at 10%)Tf (at 5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子 (As) = BAA拖尾因子 (Tf) = A + B2A10% 峰高5% 峰高色 谱 柱 背 压粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30。硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。色谱柱的背压还与流动相的粘度有

44、关。P = 3000Lt0dp2P 是色谱柱背压 (psi)，L 是色谱柱的长度 (cm), 流动相的粘度 (cP)， t0 是色谱柱死时间, dp 是粒子的直径 (m)常用色谱柱的典型流速色谱柱的保护柱柱心柱套在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同样 处理定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用含低浓度有机溶剂的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯6、使用预柱7、避免流动相组成及极性的剧烈变化8、避免压力脉冲的剧烈变化分 析 柱 的 维 护色谱柱常见毛病柱压过高多少

45、才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高 为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附流动相选择的一般要求化学稳定性好，不与固定相和样品组分发生化

46、学反应与所用检测器相匹配，不影响检测器的正常工作对分析样品要有足够的溶解能力，以利于提高检测器的灵敏度 流动相的黏度要小，以保证合适的柱压降 无毒或低毒，易于操作易于制成高纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境正相色谱流动相 常用流动相为烷烃：戊烷、己烷等 通过填加二氯甲烷、短链醇、四氢 呋喃等极性较大的溶剂来调节流动 相的极性 正相色谱最常用的流动相洗脱强度： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇反相色谱流动相通常以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等反相色谱溶剂洗脱强度的强弱顺序为： 水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷（其中二氯甲烷无法与水混溶，常用来清洗被强保

47、留样品污染的色谱柱）在分离极性和离子型化合物时常采用缓冲溶液作为流动相水 的 等 级纯化水蒸馏水去离子水波长 (nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率溶 剂 等 级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱甲醇 乙睛 正己烷-为HPLC 级溶剂；为分析纯级溶剂几种常用溶剂的吸光度比较图溶剂截止波长流动相的脱气易在系统内逸出气泡，影响泵的工作气泡会影响色谱柱的分离效率气泡会影响检测器

48、的灵敏度、基线的稳定性溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相发生反应流动相必须脱气常用的脱气方法氦气脱气法 加热回流法 抽真空脱气法 超声脱气法 在线真空脱气法流动相的过滤流动相用前均应过滤，尤其是配置的流动相所用滤膜为0.45m的孔径或者更小孔径的用滤膜过滤时，特别注意分清有机相滤膜和水相滤膜过滤的目的是除去微小颗粒，防止堵塞色谱柱和液路流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中贮存溶剂一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，同时防止空气中的氧和二氧化碳溶于流动相中缓冲溶液极易长霉，应尽量现用现配贮存容器应经常清洗，尤其是盛水、缓冲液和混合溶液的

49、瓶子流动相的贮存有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止长菌有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发溶剂使用注意事项避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。在有机溶剂中的有机酸溶液。含有强络合剂的溶液。四氯化碳和异丙醇或THF混合液。LC-5500的使用、维护及应用液相色谱培训（四）LC-5500高效液相色谱的使用与维护高液相色谱仪 开机前的准备工作 流动相和样品的前处理

50、 过滤 脱气 流动相的前处理：过滤设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、 0.45m或更细的水 性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过 滤器和真空泵抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒， 避免堵塞色谱柱和液路， 尤其是使用无机盐配制 的缓冲液储液瓶一个存放流动相的容器储液瓶的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料，一般常用有机溶剂的原装瓶作为储液瓶用棕色玻璃瓶作为储液瓶，可避免藻类的生长为保持流动相的纯净，应经常清洗或更换储液瓶流动相的前处理：脱气脱气的目的：使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，且脉动减小。 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比

51、增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化常用的脱气方法氦气脱气法加热回流法抽真空脱气法超声脱气法在线真空脱气法脱气机超声波清洗器样品的前处理使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀 样品需要过滤如果样品中有气泡，也要超声脱气LC-5500液相色谱仪组成简图P101泵键盘单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头泵工作原理泵使用注意事项泵不能在没有溶剂时空转，否则活塞与泵缸的密封之间磨损会造成泄漏 泵不能用具有腐蚀性的物质，pH使用

52、范围为28.5含盐流动相使用后不能长期存放在泵中，随着液体的蒸发，留下的少量盐的晶体会磨损高压密封圈和泵塞，所以在应用含盐流动相后，一定要用纯水彻底清洗泵 绝对不允许在大于最大允许压力限定值（40MPa）下操作 LC-5500主机进样阀检测器电源柱箱电源调零旋钮柱温箱液晶显示屏进样方法 1.在INJECT（进样）状态下清洗阀口 2.在LOAD（装填）状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到INJECT（进样）状态进样注意事项用注射器吸取样品后，一定要排除气泡后方可进样将注射器针头插入进样口，直到针头顶住进样阀体平面为止，且不可用力过大，以免损伤阀体密封面缓慢推进注射针，使定量管完全充满样液

53、旋转手柄时一定要快，否则对泵和柱子都会产生不良影响进样量和检测器响应的关系示意图进样体积 检测器响应值定量环体积的一半2倍定量环体积全量注入部分注入进样阀的冲洗进完样后一定要及时冲洗进样阀，特别是用含盐缓冲液作流动相，由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈将进样阀转至INJECT（进样）位置，利用液相泵输送纯水冲洗定量环及沟槽，利用注射器冲洗进样阀的阀口经常用湿润的软布清洁进样阀，特别是进样口周围进样阀使用注意事项阀应该保持在LOAD或INJECT中的一个位置。如果阀处在两者中间的位置，系统内的高压可能会破坏其密封表面 只允许用平端的冲洗注射器和样品注射器，绝对禁止用尖端（GC）注射器，以防划伤阀

54、的密封面。柱温箱结构图柱箱门保护柱色谱柱接检测器柱温箱的使用注意事项打开柱温箱电源开关，通过工作站软件设定柱箱温度使用柱恒温箱时，应先输入流动相然后再升温；关机时则相反，即先关闭升温电源，待色谱柱温度降至室温后方可停泵 在常温下操作时，则不必打开柱温箱电源 色谱柱日常使用注意事项过滤所有的溶剂和样品使用保护柱不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液开机时，流速和柱压要逐渐增加注意色谱柱的pH值使用范围不要高压冲洗柱子不能让缓冲盐溶液留存在色谱柱中，关机前要先用含低浓度有机溶剂的水溶液冲洗，然后再用纯有机溶剂来保存柱子色谱柱的更换 对于反相色谱柱的更换：拆卸色谱柱时，必须先关断柱箱电源。待色谱柱

55、柱温降到室温后，继续用溶剂如甲醇冲洗色谱柱约20min；先卸下色谱柱出口端接头，待有甲醇流出后再拧上螺帽；然后拧下色谱柱进口端接头，继续使甲醇滴入色谱柱，当柱进口端有甲醇溢出，且没有气泡时，表明色谱柱已被甲醇充满，此时可再拧上保护性螺帽。换新色谱柱的程序相反。 色谱柱更换、保存注意事项冲洗或活化色谱柱时，流出液应放入废液瓶中，千万不可接到检测器上，以免污染流通池按柱子进出口方向接入系统，不可更改色谱柱内应充满溶剂，绝不可干燥放置。正相柱用正己烷或乙腈，反相柱用甲醇。用原配的柱端堵头封紧柱两端色谱柱存放时防止震动，以免损坏柱床检测器的使用注意检测器的波长通过工作站的软件设定氘灯通电后在一分钟内起

56、辉，然后进入工作状态，一般氘灯稳定需要0.51h，稳定后就可以进样分析 ，所以要等仪器达到稳定状态，也即基线走稳后方可进行样品分析注意液晶显示屏所显示的数字要为正，通过调零旋钮调节基线与零点的位置，使基线在零点的上方。工作站界面整套液相色谱仪的维护1、在使用过含盐缓冲液后，用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）冲洗整个系统，时间为30min，流量1mL/min。本步骤主要是冲洗干净系统内含盐缓冲液。2、用纯的强溶剂（甲醇或乙腈）冲洗整个系统，时间为30min以上，流量为1mL/min 。本步骤主要是保护色谱柱。3、如果未使用缓冲液，上面步骤1可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为30min以

57、上，流量为1mL/min每次用过仪器后必须做!注意事项 流动相的选择：对样品易溶，且溶解度尽可能大化学性质稳定，不损坏柱子不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收 黏度低，流动性好 无毒或低毒，易于操作易于制成高纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境注意事项缓冲液的使用：使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响，最好是现用现配 不能直接用有机溶剂冲洗液相色谱常见问题及其对策液相色谱常见问题类型 A. 压力异常（偏高、波动） B. 漏液 C. 保留时间漂移 D. 基

58、线问题（漂移、噪声） E. 峰形异常现象：无压力，流动相不流动可能原因： 1、柱塞杆折断 2、泵头内有空气或流动相不足 3、单向阀堵塞 4、漏液 5、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)压力异常现象：压力持续偏高或不断上升可能原因： 1、流速设定过高 2、保护柱或柱子筛板堵塞 3、流动相使用不当或有缓冲盐析出 4、色谱柱选择不当 5、进样阀损坏压力异常现象：压力持续偏低可能原因： 1、流速设定过低 2、色谱柱选择不当 3、柱温过高 4、系统漏液压力异常压力异常现象：压力波动可能原因： 1、泵头中有气泡 2、单向阀损坏 3、柱塞密封圈损坏 4、脱气不充分 5、系统漏液 6、使用了梯度洗脱漏

59、液接头处漏液 可能原因： 1、接头处松动 2、接头磨损 3、接头被污染 4、部件不匹配 漏液泵漏液 可能原因： 1、单向阀松动 2、泵密封圈损坏 3、接头松动（不要拧的太紧）进样阀漏液 可能原因： 1、转子密封损坏 2、定量环堵塞 3、进样口密封松动 4、进样针尺寸不合适 5、废液管产生虹吸 6、废液管堵塞漏液检测器漏液 可能原因： 1、流通池垫片损坏 2、流通池透镜破碎 3、废液管堵塞 4、流通池堵塞漏液保留时间漂移 可能原因： 1、柱温变化 2、流动相组分变化 3、色谱柱没有平衡好 4、流速变化 5、泵中有气泡 6、流动相选择不当 7、键合相流失保留时间漂移基线漂移 可能原因： 1、温度波

60、动 2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂) 3、流通池被污染或有气泡 4、流通池窗口破裂 5、流动相配比不当或流速变化 6、色谱柱没有平衡 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出 9、检测器没有设定在最大吸收波长处基线问题基线噪声（规则的） 可能原因： 1、流动相、泵、检测器中有气泡 2、有地方漏液 3、流动相混和不均匀 4、温度影响（检测器和柱温差别太大） 5、其他电子设备的影响 基线问题基线噪声（不规则的） 可能原因： 1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成 2、有地方漏液 3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀 4、流通池污染 5、检测池能量不足