考马斯亮蓝法测定实验报告

1、.1考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡 郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果说明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.9

2、3%。关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物1 实验局部1.1 实验原理果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成局部，参与果蔬多种生理生化代过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度围，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的

3、增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间到达平衡，完成反响十分迅速；其结合物在室温下1h保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反响非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度围为01 000g/mL，最小可测2.5g/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法线性围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。1.2 实验准备1.2.1 实验材料新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷

4、(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸EDTA、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2 、抗坏血酸、半胱氨酸、-巯基乙醇。1.2.2 仪器与设备容量瓶25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶 1个、分析天平、胶头滴管、烧杯50mL 2个、移液管20mL、量筒10mL 1个 、25mL 1个、研钵、移液枪1000LUV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。1.2.3 试剂配制1.2.3.1 标准蛋白质溶液(100g/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL； 考

5、马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 90%乙醇中，参加50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中； 提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)； 梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L； 1.2.3.5 外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸

6、(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、-巯基乙醇(2%，V/V)。1.3 实验步骤考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反响液全波长扫描取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反响液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400800nm围进展扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反响液的最大吸收峰和空白吸收值。 标准曲线的绘制取6支试管，按表1参加标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中参加5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波

7、长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程 表 1 绘制标准曲线的各试剂添加量 工程 管号012345100g/mL 牛血清白蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.60.40.201.3.3 果蔬组织可溶性蛋白质的提取 最正确缓冲溶液和pH值确实定称取苹果果肉样品1g，参加5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用。 最正确提取缓冲液浓度确实定 以上节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH

8、值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液9。提取体系及方法同节。.3 适宜外源添加物确实定 以上节确定的最正确缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法节。添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP-巯基乙醇、PVPEDTA、EDTAPVP-巯基乙醇1.3.3.4 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 吸

9、取1.0mL样品上清液，放入试管中，参加5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。 数据处理E*cel 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。2 结果及讨论2.1 标准曲线的绘制表二 不同吸光度值对应BSA含量BSA含量g020406080100吸光度A00.1440.2680.3660.4470.541查阅文献得，可溶性蛋白质质量浓度高时，考马斯亮蓝G-250染色法线性降低，R=0.9929。可溶性蛋白质量浓度在80g/mL以时，该方法线性关系较好，相关系数R=0.9929。因此，考虑到该方法高浓度时非

10、严格的线性关系，实际应用时，相关系数R在0.99-1围属根本可以承受围。本实验R=0.9990，线性很好。2.2 不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响不同缓冲溶液对可溶性蛋白提取效果的影响表三 水及不同pHTris-HCl对可溶性蛋白提取效果的影响溶液及PH值水PH=7.2PH=7.4PH=7.6PH=7.8PH=8.0PH=8.2PH=8.4PH=8.6PH=8.8PH=9.0吸光度A0.1290.1510.180.1630.1660.1600.1720.1860.2010.2180.258蛋白含量g19.1923.2923.1125.5326.0924.9727.2029.8132.61

11、35.7843.23蛋白含量%15.3518.6318.4920.4220.8719.9821.7623.8526.0928.6234.58其中，1-11分别代表水、pH为7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl缓冲溶液100mmol/L不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响通常利用考马斯亮蓝G-250染色法测定植物组织微量的可溶性蛋白时，常选用的提取液包括水、Tris-HCl缓冲液和磷酸PBS缓冲液。本实验研究了水以及不同pH值的Tris-HCl缓冲液定苹果组织低量可溶性蛋白质的提取影响。在Tris-HCl缓冲溶液100mmol/L有效

12、缓冲围()选取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1:5料液比制备可溶性蛋白质提取液，按制作标准曲线方法测定提取液可溶性蛋白含量，测定结果如以下图。由图可以看出：随Tris-HCl缓冲溶液pH值的升高，可溶性蛋白质的提取效率增加；且Tris-HCl缓冲溶液提取效果明显优于水提组，其中pH7.2的Tris-HCl缓冲溶提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量仍然比水提组高17.55%；提取缓冲液pH值为9.0时提取效率最高，比水提组和提取组pH值为7.2分别高125.27%、85.61%。查阅文献得，整体上Tris-HCl缓冲溶液提取效

13、率高于磷酸盐PBS缓冲溶液苹果果肉组织可溶性蛋白质提取的适宜缓冲溶液为pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液。 不同缓冲液浓度对可溶性蛋白质提取效果的影响表四 不同浓度Tris-HCl对可溶性蛋白质提取效果的影响溶液mmol/L010305080100吸光度A0.1290.1490.1660.1960.2380.264蛋白含量g19.1922.9226.0931.6839.50 47.33蛋白含量%15.3518.3420.8725.3431.60 37.86其中，1-6分别表示浓度为0、10、30、50、80、100mmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液常用可溶性蛋白质提取缓

14、冲液浓度为0.020.05mol/L缓冲体系，实验过程中，选择0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进展实验，结果如以下图。由图可知，低浓度 pH为9.0的Tris-HCl缓冲条件即可明显提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量比对照水提组高19.48%)。且随着Tris-HCl缓冲液浓度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、50、80、100mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量分别比对照高35.96%、65.08%、105.86%、146.64%。其中，100mmol/L缓冲液提取效果最正确，其可溶性蛋白有

15、效提取量比80mmol/L缓冲液仍高出19.81%。2.2.3 外源添加物对可溶性蛋白提取效果的影响以上述实验确定的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为根底提取液，添加蛋白酶保护剂和抑制剂，进一步探讨外源添加这些物质对真实测定果蔬组织中可溶性蛋白质的含量的影响。分别选取抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巯基乙醇、NaCl、MgCl2以及这些试剂的不同组合进展实验，以不添加任何添加物的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为对照，结果如以下图所示。 表五 不同外源添加物对可溶性蛋白质提取效果的影响外源添加物抗坏血酸半胱氨 酸EDTAPVP-巯基乙

16、醇NaClMgCl2PVP-巯基乙醇PVPEDTAEDTAPVP-巯基乙醇无吸光度A0.2150.2430.3260.3540.1730.1630.1800.1910.3830.2010.261蛋白含量g35.2240.4355.9061.1227.3925.5228.6930.7466.5232.6143.44蛋白含量%28.1832.3444.7248.9021.9120.4222.9524.5953.2126.0934.75其中，A-J分别代表抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP-巯基乙醇、PVPEDTA、EDTAPVP-巯基乙醇单独添加2mmo

17、l/L半胱氨酸对可溶性蛋白提取效果无明显影响；单独添加2mmol/L抗坏血酸、0.15mmol/LNaCl、2%-巯基乙醇和0.15mmol/LMgCl2对该浓度和pH值的缓冲液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，这4种物质处理后，可溶性蛋白提取量分别比对照组低23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。从-巯基乙醇和PVP及EDTA的复合处理结果也可看出其对果实可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP-巯基乙醇处理组可溶性蛋白测定量比PVP处理组低，PVPEDTA-巯基乙醇处理组可溶性蛋白含量比PVPEDTA组低；单独添加PVP和EDTA均有助于提高果实可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比对

18、照高40.71%)好于EDTA(比对照组高28.69%)。而PVP和EDTA复合处理效果比单独处理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量比对照高53.12%。2.3 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 表六 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定次数工程吸光度蛋白含量g蛋白含量%平均值10.26043.6034.8834.9320.26344.1635.3330.25843.2334.58上述研究结果说明，以考马斯亮蓝G-250染色法测定组织微量蛋白含量时，果实可溶性蛋白提取受提取液pH值、缓冲盐种类、缓冲盐浓度、外源添加物PVP和EDTA等因素影响。实验最终确定的适用于苹果果实可溶性蛋白含量测定的提取条件为，

19、0.1mol/L,pH为9.0的Tris-HCl提取缓冲液(含1mol/LEDTA和1%PVP)，1:5料液比，此条件下，果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%mg/g3 其他3.1 实验流程图3.2 考马斯亮蓝法的优点3.2.1 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。3.2.2 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时保持稳定

20、，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。3.2.3 干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。3.3 考马斯亮蓝法的缺点3.3.1 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。3.3.3 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton *-100、十二烷基硫酸钠SDS和0.1N的NaOH。如同0.1

21、N的酸干扰Lowary法一样。3.3.3 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进展计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。3.4 染料考马斯亮蓝有G250 和R250 两种形式在颜色索引Colour Inde*中给出了不同的编号42655和42660。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白有效地进展染色，使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水50:10:40的0.05%溶液。但考马斯亮蓝R250尤其适用于SDS电泳微量蛋白质的染色,所以本次实验选择了考马斯亮蓝G250。3.5 测定时间蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反响十分迅速，在2min左右反响到达平衡；其结合