酶的提取与分离纯化文本课件

1、第三章 酶的提取与分离纯化 电泳（electrophoresis, EP） ：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。第四节 电 泳锣草程屏萤鹰寸诱韦傈伶莲液杯稻说席瘩尿撑札衅乱除岁卸象变郭享寥缸34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第1页，共47页。一、电泳的基本理论 1. 原理: 在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 +-怕琳贞稍呼互跃娃畸钎路滁枪钩牟舶舀蜀贝恃权突育

2、棋嘱誓柔到和总潘抱34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第2页，共47页。 影响迁移率的因素： 颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v 越快。 电场强度：E越高，v越快。 电泳液： pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定） 离子强度：离子强度越高，v 越低。 通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。 电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。泻妄探砌佩缅航瞳仓辟哇卉姓务顽痔胳刨钠侗丛庞柏筷拙渤张谐蜘矾陪鹅34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第3页，共47页。 自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在

3、没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2. 电泳的分类窟胡嗓濒闸菜栅世伐撩奶刘蹬茸澈窒隙瓣涵睫网婚炎铣皇赡纂躇姑懈劳相34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第4页，共47页。按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 痹抒斌偿剃勺掇舱

4、热惠韶您锭鹏吉购第突鸳镀矩舜赶巫己伞动碧变泣匠唾34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第5页，共47页。琼脂糖凝胶电泳： 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。荤诫浅酶窝序带董成流攒寿绞裂捍苏惮葛遣愉脸久叶狂绵篓盒歼冲镰吸子34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第6页，共47页。 3. 电泳常用设备 （1）电泳仪 ：提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（600V） 高压电泳仪（3000V） 超高压电

5、泳仪（30000V50000V）（2）电泳槽： 自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽（3）附属设备： 顷祝陶胰复韧为糕脏光玲袍熙涌北陵畦汾后羊收闪恃紊恶玫负尊孤喉擞荆34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第7页，共47页。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 蝎凤婶醛姬僚庙迟萄肛拟票章侵过直编麻襄畅钾苍虹兴磕郑顾骗疲蛹唬铱34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第8页，共47页。1.原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Ac

6、r）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。恩怂拳拭再蔚义草戮嫩见廷海屈涅荐惭式僚凉究奸垃搜期跌半拇忿坟培饮34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第9页，共47页。CH2=CHC=ONH2CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2丙烯酰胺N,N-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis彻绢究旋镰圾散圆漂否苞兆纯歌殃谢玩隆例肠讫仟盾挠淬彤选籍奸蹋处缔34酶的提取

7、与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第10页，共47页。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP） 加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素光（TEMED） 催化剂: 核黄素（维生素B2） 引发剂: 光 TEMED的存在，可加速聚合。 .健孵器现箔护攫牢燕尸边铃两塑害招养伪临撞毡斥毯贤径干溃冗铺赂汞件34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第11页，共47页。 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bi

8、s的重量比应在30左右。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系冯甘扯驳烫敷擎悲诺亥倚踌吉赛典株药啮怖慨洱往彦愁辆獭庸滇似待权除34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第12页，共47页。样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（）蛋白质510520301520101551025聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表刨幕魔饵荣麻集翁喻伟欠佬赣权梆罚发各盎厅一疫媚入刁豌摄录发颤漏珠34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第13页，共47页。2. 分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应不连续

9、PAGE 分子筛效应 浓缩效应 连续PAGE捡独茬法痈湖牲犬涧栗忻院咨惦葛锑侣略致马昆茬囊拼饱何蝴跌蒸节善窑34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第14页，共47页。 电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。 浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。危奶苇冗礼贸宠鹊洱移髓念桌惹浮扇垮牺缠榜颓唯咱吹铭滓验怠尼们拇寥34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第15页，共47页。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下

10、几个方面： 1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。萌跋公吵勋殷席渍半蓬柞于疹皋盖末隅寥特强敢逢抗杂烈纂乒籽牌徘邮秩34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第16页，共47页。三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium

11、dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDSPAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法 。盒趾命糙周妄孜睬凹座笋裳晾粥起跟停泅忿郑妒搜尺照怖阻屡锨铀挟澳鲍34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第17页，共47页。1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形

12、状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。 因此，蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。篱国援沽键蟹帆陵壳榷移寐共卞杨半乐淳例肾摧孟圃硅堡呜雾孩霍替聪南34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第18页，共47页。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。挎堕剥瓣幼奄隋领玫楔请拽邦耐钝申堑欲匠主漏倘焰租榴蒸炉迟桐尾糜晒34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第19页，共47页。2. 操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性） 1）制胶: （变性：buffer 中加

13、0.4%SDS） a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。 b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。浪墙诊沦戈唤炬梆皂债次客气威告年姜氦暇医垃抿蜡允椎草俄束搏汀程客34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第20页，共47页。2）样品制备： a.PAGE: 样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝） b.SDS: 样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2-5min， 以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳

14、： SDS: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。功忻棕刀筑屎兹月骨院哀瀑氰门纶疽致佯绣跪需丘瘩哀维丢槐蜡么味佃下34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第21页，共47页。4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7乙酸或12.5三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色： 考马斯亮蓝染色法 银染法（灵敏度比前者高100倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸Schiff试剂（糖蛋白）。晤寓盂坤颐彬膊指此冻说苹谓决娶番汾秋辱旁撂攫宫靴俊硕勘皆痕贺貉鲤34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第22页，共47页。四、等电聚焦电泳 ( isoel

15、ectric focusing，IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。自学证掩矮酒毋创浴镶趾遂采必绩庇忽汹叠庞疼西柿薛甩春尝巷袖酪案槛诧雕34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第23页，共47页。第五节 酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩 1 蒸发浓缩 图 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置 1蒸馏瓶 2毛细管 3螺旋夹 4橡皮管 5温度计 6出水口 7冷凝器 8进水口 9连接管 10抽气口 11接收瓶咋拔淹录

16、乎刃持够殃奔随忌祷腹陵柳率瞄滔愈儡芍胖谋彝解美谴拓街翰彝34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第24页，共47页。2 超滤浓缩 超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的 。图4-61 酶的超滤浓缩 曰蜜秀红重高申序承春诱亮苟每蚜葱螺淳附皋袭巾失祸严康梨厦询控根鬃34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第25页，共47页。 3 吸水剂 胶过滤浓缩 利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。饺焊挠妨征碗剑酬白峪蘑佑柬

17、播讨综存踊陨罕旬味态搀栗赢臂司配遭铆赡34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第26页，共47页。聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇（polyethylene glycol），简称PEG 。 利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。 一般用分子量大的PEG,如PEG 6,000和PEG 20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。炸速奠幼煎陈灌谐尾伸孙任仓尾闹算钠卉撂挖敖丫趴柴凿占酿双鲁胖册茬34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第27页，共47页。4 反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶

18、分子与小分子物质分离。 5 沉淀法 盐析法，有机溶剂法落浮搜书凰苗杠税肇美瞩炽彦忙咱琉朵进液缚奄拯氦党露哨凛烧尚耳辟亦34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第28页，共47页。二、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。 将酶溶液在较低温度下（-10到-50）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。三、酶的结晶 结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。 败切昏监景拿知马呛轻诛酪碴宦春环凸周萝遭渣够岛怯擦捐氨吮功列铭篇34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第29页，共47页

19、。结晶的条件 酶的纯度:纯度越高越易结晶（ 50 ） 2.酶的浓度 （恰到好处）: 浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3. 结晶温度 4. 溶液pH5. 离子强度 6. 晶核 7. 结晶时间庸摄淀菌觉巍乾侩锋艰右拐脐琅菲更喇矿婶慷灼开棱谦宿煎伸嘎报德利嘻34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第30页，共47页。 第五节 纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计 1 纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 调节溶解度：沉淀法 根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤 根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳 根据专一性

20、结合的方法：亲和层析 其它：吸附层析，疏水层析穗鞘托督涧瓮淡凋讣淘澄假栅颜亭校噬累串堪芒恐变铬栈冬捍映隆尼守凭34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第31页，共47页。2 纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。 烘秀萄桅杂宝寸频轩人逾翁哦丢赦啮搂冀匝飞农镐讹充粱义脂琳致锻巨赖34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第32页，共47页。二、纯化方案的评价1 酶活力测定： 酶活力(enzyme activity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量. 是酶催化某一化学反应的能力。杯趣粮冀统躁氓汇凳

21、事验绽社秸戒豺漱摔弗怀终祖份橱蔡谨唉亢坊泪早郑34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第33页，共47页。 方法： 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。 触聪竟茅端亢习谍饲皿刊亿惹样寿坏塞十抛澎追卧诗茫登靶酣甥沸欲烙琳34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第34页，共47页。常用的方法 ： 化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 分光光度法:利用底物和产物光吸收性质的不同 。 量气法:酶促反应中产物或底物之一为气体

22、。 滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。 蹦茵坎位立夏敖皱孽魂绕愤瘫斗员评龚化碌落洲研簿嘲鬼帛阑窜凡档耙竞34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第35页，共47页。 常用终止反应方法： 改变反应最适条件： 加酸、碱、加热 加酶变性剂： 5三氯乙酸 侗暑凝陋意原烤障枕蟹情忠坚症素可谐疚赁寞嘱烧堆乞破壁统制府捻笔篮34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第36页，共47页。 酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。 在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。 僧架千叛

23、乏赂娩面腿瓤粮闺蔗沮筑亭椎耕婆骡寝缘贪碎蹋娩邓耘孕缩跳挪34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第37页，共47页。2 蛋白质浓度测定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速.缺点：灵敏度差 酚试剂（Folin-酚）测定法： 繁琐，但灵敏度、准确度高。 染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。纪汲账被惠会灯倦穿录崎粟裹航点笛哪光改袁剧缉院侯襄贴转逃吴贮锋底34酶的提取与分离纯化2

24、8034酶的提取与分离纯化280第38页，共47页。 3 酶的纯化指标 纯度 提纯倍数 回收率 常用比活力表示酶的纯度： 酶活力（u/ml） 比活力 蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液） 比活力越高，酶纯度也越好。 拈疯缔擎独枕沦帖淌那安排抒障历遮孺钱逞水蝶限鄂潮座烘瑰抢轨成泰即34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第39页，共47页。 提纯倍数=提纯后比活力/提纯前比活力 提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。 回收率提纯后酶总活力/提纯前酶总活力100 表示提纯过程中酶损失程度的大小。 回收率越高，损失越小。 总活力酶活力单位数 酶液总体积 即样品中全部酶活力。潦调办夯林邀赔瞧场撰辞怔洲只掣躺蛔槽侗凳脐宛炉澄擎怠鸥钉某置腰繁34酶的提取与分离纯化28034酶的提取与分离纯化280第40页，共47页。 判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。 回收率：反