粪便标本中致病菌的检验实验设计材料

1、临床模拟标本细菌学检验的实验设计书1.标本分析标本中可能的正常菌群：正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌、肠球菌、大肠埃希菌、肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等。标本中可能存在的病原菌：细菌性：吸收不良性腹泻，包括致病性大肠埃希菌等；产毒素性腹泻，包括霍乱弧菌、肠毒素型大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、变形杆菌、气单胞菌属、蜡样芽胞杆菌等；侵袭性腹泻，包括志贺菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌等；食物中毒，包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、乙型溶血链球菌和肉毒梭菌等；伪膜性肠炎，包括艰难梭菌或金黄色葡萄球菌；慢性腹

2、泻，可能由结核杆菌引起；继发性肠道感染：铜绿假单胞菌、非结核分枝杆菌等。真菌性：念珠菌、毛霉菌等。病毒性：轮状病毒等。检验思路 图1-1 粪便标本细菌学检验程序3.拟采用的实验方法及预期结果（1）显微镜检查（仅在怀疑为霍乱弧菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌感染等情况下进行）不染色标本检查：用生理盐水或卢戈氏碘液或0.1%亚甲蓝染液与等量的粪便标本混合均匀涂于载玻片上，盖上盖玻片用相差显微镜或暗视野显微镜高倍镜镜检。A.若标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼，提示霍乱弧菌感染。此时加入O群或O139群霍乱弧菌多价诊断血清，显微镜下观察与不加诊断血清比较，若大于8

3、0%的细菌停止运动或运动明显减弱，判断为制动试验阳性，可初步报告为“疑似O群或O139群霍乱弧菌”。B.若发现呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌，提示为弯曲菌。C.若高倍镜观察发现有无光亮的卵圆形孢子或假菌丝可初步报告酵母样真菌感染。染色检查：如细菌染色呈现下列典型形态时，对诊断具有提示作用。A.取新鲜米泔样类便标本涂片2张，用乙醇或甲醇固定，分别进行革兰染色和1：10稀释苯酚复红染色，油镜观察呈鱼群状排列的杆状或弧形红色革兰阴性杆菌。提示为霍乱弧菌。B.粪便做革兰染色，镜检发现细小、长而弯曲，呈S形或螺旋形、海鸥状的革兰阴性弧菌，可初步报告“疑似空肠弯曲菌”。C.取水样便涂片，革

4、兰染色，若发现大量散在或成堆（葡萄状）排列的革兰阳性球菌同时伴随革兰阴性杆菌明显减少，疑为引起伪膜性肠炎的葡萄球菌。D.抗生素相关性腹泻的主要病原菌，大便呈黄绿色糊状便或暗绿色海水样便，黏液多，有时可见片状伪膜，涂片革兰染色可见大量革兰阳性粗大杆菌、无荚膜、卵圆形芽胞位于菌体一端同时伴有炎症细胞疑为艰难梭菌。E.涂片革兰染色见瓜子状革兰阳性孢子或假菌丝，可初步报告检出酵母样真菌。F.取蚕豆大小小的粪便与饱和生理盐水10ml混合，静置1小时，取表面液体涂片进行抗酸染色，发现红色抗酸杆可报告“找到抗酸杆菌”，提示为结核分枝杆菌。（2）培养与鉴定 标本用分区划线法接种于普通琼脂平板、SS、麦康凯、血

5、平板等培养基接种培养，置于37培养箱中培养1824h，观察生长情况。革兰阳性菌的分离培养与鉴定A.球菌，葡萄状排列，在普通平板上形成金黄色菌落，在血平板上形成圆形凸起、光滑，呈金黄色或橙色菌落，有透明溶血环。触酶试验阳性，血浆凝固酶试验阳性，氧化酶实验阴性，甘露醇发酵试验阳性：可判断为金黄色葡萄球菌。B.球菌，成对或短链状排列。菌落光滑、灰白色、圆形凸起，可呈现不同的溶血现象。触酶试验阴性，胆汁七叶苷试验阳性：可判断为肠球菌。C.球形或椭圆形，链状排列。在血平板上可形成灰白色细小菌落，触酶试验阴性，杆菌肽敏感试验阳性，胆汁七叶苷试验阴性：可判断为乙型溶血链球菌。革兰阴性菌的分离培养与鉴定A.直

6、或弯曲杆菌，在普通琼脂平板上产生水溶性绿脓素，使整个培养基变为绿色，氧化酶试验阳性：可判断为铜绿假单胞菌。B.粗短杆菌，在普通琼脂平板上形成大而湿润的黏液状菌落，血平板上不溶血，在MAC上呈粉红色或红色菌落，SS上粉红色菌落。氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，氨基酸脱羧酶试验阳性，MIU：+-，硝酸盐试验阳性：可判断为产气肠杆菌。C.杆菌，MAC上无色透明，SS上无色透明，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阳性，氨基酸脱羧酶试验阳性，硝酸盐试验阳性：可判断为摩根菌。D.在MAC平板上粉红色，在SS上为粉红色或中央为粉红色、周围无色的菌落。氧化酶试验阴性，触酶试

7、验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，氨基酸脱羧酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，KIA试验：A/A产气，MIU试验：+-（动力试验阳性，吲哚试验阳性，脲酶试验阴性），糖类发酵试验产酸产气，IMVC试验：+-（吲哚试验阳性，甲基红试验阳性，VP试验阴性，枸橼酸盐利用实验阴性），硫化氢试验阴性，O-F试验为发酵型：可判断为大肠埃希菌。E.MAC上无色不透明，SS上无色不透明或透明。氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，氨基酸脱羧酶试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，KIA试验：K/A，MIU试验：-V-（动力试验阴性，吲哚试验不定，脲酶试验阴性），IMVC试验：V+-（吲哚试验不定，甲基红试验

8、阳性，VP试验阴性，枸橼酸盐利用实验阴性），硫化氢试验阴性，血清学分型鉴定阴性：可判断为痢疾杆菌。F.在SS上中央为黑色不透明或透明、无色的菌落，MAC上较小，无色透明。氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，氨基酸脱羧酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，KIA试验：K/A，MIU试验：+-（动力试验阳性，吲哚试验阴性，脲酶试验阴性），IMVC试验：-+-+（吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，VP试验阴性，枸橼酸盐利用实验阳性），硫化氢试验阳性，血清学分型鉴定阳性：可判断为沙门菌。G.在SS培养基上的菌落中有黑点，普通琼脂平板上可见迁徙现象，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试

9、验阳性，氨基酸脱羧酶试验阴性，脲酶阳性的可判断为变形杆菌。真菌的分离培养与鉴定 A.将标本用分区划线法接种于科玛嘉念珠菌显色培养基平板上，置35培养1824h。形成紫色菌落的是近平滑念珠菌，形成绿色菌落的是白念珠菌。4.所需器材及试剂实验器材：酒精灯、显微镜、载玻片、镊子、滤纸条、接种针、接种环、移液枪、37培养箱、香柏油、擦镜纸。实验标本：粪便标本。实验试剂：平板：SS平板、麦康凯平板、普通营养琼脂平板、石炭酸平板。试剂：革兰染色液、生理盐水；触酶实验：3%过氧化氢溶液；氧化酶试验：氧化酶试剂；苯丙氨酸脱氨酶试验：苯丙氨酸培养基；KIA斜面培养基；MIU培养基、吲哚试剂；氨基酸脱羧酶试验：氨

10、基酸培养基、对照培养基、无菌液体石蜡；硝酸盐还原试验：硝酸盐还原培养基、硝酸盐还原剂（甲液和乙液）；O-F试验：葡萄糖氧化发酵管。5.实验进度安排第一天：进行显微镜检查和倒平板，观察待测菌革兰染色镜下图并分析为革兰阴性菌还是革兰阳性菌，然后将标本用分区划线法接种于SS平板和MAC平板，置37培养箱中培养1824h。第二天：观察MAC和SS平板上菌落特征，分别挑取不同单菌落进行革兰染色再次确认为革兰阴性细菌还是革兰阳性细菌，然后分别进行氧化酶试验、触酶实验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、KIA试验、MIU试验、硝酸盐还原试验、接种普通平板与石炭酸平板等。记录并分析各实验结果，且分析有几种

11、细菌存在。 第三天：分析结果，观察普通平板上菌落情况有无发生迁徙现象，没有则排除变形杆菌。分别在苯丙氨酸培养基中加入23滴氯化铁溶液后，观察有无变绿，分别观察氨基酸脱羧酶试验测定管和对照管颜色变化，分别观察KIA培养基斜面和底层颜色、有无产生气泡、培养基有无变黑色，分别观察MIU培养基穿刺线是否清晰、培养基有无变红、加入吲哚试剂上层有无变红，分别观察硝酸盐培养基加入硝酸盐还原剂后有无变红并记录各实验结果，然后做血清学分型鉴定试验，鉴定细菌种类。若有两种细菌存在，且实验结果与事实不符，分析得可能出现污染需重复试验，再次接种在SS和MAC平板上，进行分离培养。2021.12.9：观察MAC和SS平

12、板上形成的单菌落的颜色形态并记录，做重复试验，挑取单菌落进行MIU试验、硝酸盐还原试验、O-F试验，对实验结果进行综合分析和处理，得出实验结论，完成实验报告。6.注意事项：（1）挑取菌落时要小心谨慎，防止出现杂菌污染，若出现污染应立即重复试验，遵循实验事实，保证结果可靠性。（2）注意实验室消毒安全和无菌操作，细菌鉴定操作必须严格遵循有关制度。（2）肠道内存在大量的正常菌群，除非为了正常菌群的调查和鉴定，一般分离可疑致病菌应使用选择性平板。（2）最好采集急性期和抗生素使用前的粪便标本，进行床边接种。怀疑沙门菌感染时，应在发病2周后采集。（3）除怀疑霍乱弧菌、结核分枝杆菌和菌群失调引起的腹泻外，粪便标本一般不做涂片检查。在以糖类发酵为鉴别依据的培养基上，发酵型菌落进行氧化酶试验