细菌耐药监测的质量控制课件

1、细菌耐药监测的质量控制湖南省临床检验中心赵艳华细菌耐药性监测的的意义：监测病源微生物对抗生素的敏感性和耐药性，避开其耐药机制，指导合理用药抓好细菌耐药性监测中的质量控制，是保证监测数据的准确性、可靠性的至关重要的环节各成员单位进行耐药监测工作时需严格执行质量控制措施。 外部质量控制体系 内部质量控制体系 内部质量控制体系：各成员单位临床微生物室（科）要建立完善的质量管理体系，建立健全室内质量控制体系； 外部质量控制体系：各成员单位定期参加国家或省临床检验质量控制中心的质控考核并合格。 质量控制概念的引入历史上，现代风险管理的概念引入实验室之后，就以质量控制的形式出现。狭义上指的是一项持续的、系

2、统性的评估工作来确保终产品的一致性根据可接受的程度：事先建立好的允许限度下的精确度和准确度。细菌耐药性监测的内部质量控制体系主要目标 保证实验结果的准确性、可靠性和可重复性实验室应对分析前、分析中、分析后三个阶段实行全面质量管理标本分析前的质量控制： 微生物学特殊性得到正确分析结果的基础样本质量控制样本质量是影响细菌学实验室结果的关键环节实验室应给标本采集者提供标本采集和运送的指导手册实验室应持续监测标本采集和运送过程实验室应对标本质和量（包括体积和数量）进行监测样本质量控制标本采集：采集部位、采集数量和体积、采集时机、污染标本保存：保存条件、保存时间标本运输：防止污染标本验收：标本采集时间、

3、标本量、标本评估标本分离接种：病理成分的选取、选择合适的分离培养基和方式收集和运送微生物标本的容器要求1、无菌2.无防腐剂3.足够大4.安全严密5.不易碎6.运送培养基 加强无生长因子或保持特定菌的培养基避免用木质的棉试子对细菌有毒害收集细菌实验的标本避免污染抽血前，皮肤必须经过严格消毒。如果可能，化脓性损伤应通过皮肤抽血，因为这种方法比黏膜更容易消毒液体标本比拭子标本更适合检测。抽取物用注射器送到实验室之前应先把针头去掉，注射器口用安全帽封好。开放伤口，擦去表层分泌物，防止其它细菌干扰。 用拭子取伤口边缘处运送时间及运输贮存温度运送时间-短，运输贮存温度因细菌不同而异标本因冷藏及pH改变或在

4、氧气中暴露，可能减少很多种细菌的存活时间 脑膜炎球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，布氏杆菌，沙门菌，志贺氏菌，霍乱弧菌，空肠弯曲菌及厌养菌。 对环境敏感菌株在运送中数量快速减少时，如果运送时间太长，其它菌则成倍增长，这给需定量评价数的培养造成困难（尿标本），需要寻找的细菌可同其它菌一起过度生长。 需进行细菌学检测的所有标本，应在收集后2小时内送到实验室 各种标本的运送及贮存条件标本运送贮存温度血血培养瓶 室温或37 脓 、脑脊液 、胸水、心包液 、腹水、关节滑液 、鼻窦分泌物 短时间内运送: 标本在带帽的注射器内保证厌氧条件；长时间运送：使用运送培基室温，不用培养，避免冷藏支气管肺泡

5、灌洗液、痰，其它分泌物 、便 立刻送检（2-3小时）冷藏眼 、耳 、嘴、咽 、鼻、尿道、生殖道 、直肠、伤口拭子放在运送培养基(4小时运送时间)室温，不培养痰标本合格标准痰标本留取后应先涂片, 进行革兰染色镜检合格后再接种痰标本鳞状上皮细胞白血球细菌种类合格=101-3种不合格=25/低倍3种拒收标本指标 除非不能再采集的标本，否则不予检测；如果培养或检测，要对结果进行说明。书写错误容器问题干燥试子厌养菌容器无菌、无防腐剂、足够大、安全严密不易碎、运送培养基、无生长因子或保持特定菌的培养基、避免用木质的棉试子对细菌有毒害细菌学实验室检测方法确认临床细菌学实验室选择的检测方法准确性和重复性好检测

6、结果的临床相关性好 更换新的检测方法应证明其准确度和精密度良好应在工作人员具备相应的操作能力和具备研判和报告结果的能力后进行细菌学实验室检测方法确认不需确认的试验方法SFDA批准的一般试验不需进行确认试验单个试剂和培养基通过日常质控进行检测，不需进行确认试验 需确认的试验方法如抗菌药物敏感试验 血培养 非培养的检测方法SFDA批准试验方法的改良方法未经SFDA批准的方法自己开发的方法细菌学实验室检测方法确认确认的内容实验室可否获得与制造商相同的检测结果非商品检测方法应与可接受的参考方法进行比较应评价方法的敏感性、特异性、准确性、精密度和预测值细菌学实验室检测方法确认方法确认需至少20个阳性标本

7、和20-50个阴性标本至少检测12-15个种的50株菌与参考方法比较，新方法的敏感性和特异性应95%经方法学确认的试验方法，在实践中应记录其质控资料、人员能力、PT结果、仪器校准、临床相关性等资料，达到临床确认分析中质量控制 常规仪器和设备 成品商业培养基（诊断抗血清）、试剂设备的质量控制预防性维护与保养可保证仪器的精确性和使用寿命按照制造商的建议，有计划的定期检查可减少仪器故障和维修需要明确维护保养的责任是保障设备完好的前提商家的支持是保障设备完好的后盾设备的质量控制新设备的检查，包括如安全性、配件、有无破损等新设备比对实验（与旧设备比对或与参考设备或方法比对）设备运行记录、维护保养记录、维

8、修记录制定和执行标准操作规程培训操作人员设备的质量控制培养箱、冰箱、水浴箱 每天有温度记录二氧化碳培养箱 每天检查CO2含量高压灭菌器和干热灭菌器 应有温度记录装置和灭菌指示剂厌氧罐或厌氧箱 美篮为指示剂，无氧时应无色生物安全柜 更换滤网由专门技术人员进行细菌培养仪 对每批培养瓶进行生长试验。保证在有效期内使用微生物鉴定仪 及时更新系统操作软件 使用细菌鉴定仪要注意维持比色的清洁，不要在比色板上方添加试剂；取、放鉴定条要小心，以免打翻溢出；比色完毕即将比色板送入机体内。定期请工程师校对比色、比浊系统，也可用标准菌株作质控对照 仪器设备质量控制标准 设备 控制标准 允许范围高压灭菌器 121 1

9、21 孵育箱 35 1 水温箱 37 1 冰箱 4 2 低温冰箱 -20 5 二氧化碳培养菌 5%10% 10%培养基质量控制 1 一般性状 培养基的一般性状包括外观、厚度、 pH 值等 液体培养基、固体培养基2 无菌试验 压力蒸汽灭菌后倾注的固体培养基 灭菌后无菌操作分装的液体培养基 无需高压灭菌只需煮沸消毒的选择性培养基培养基名称 质控菌株 ATCC 鉴定标准 血平板 金黄色葡萄球菌化脓性链球菌肺炎链球菌大肠埃希菌 2592319615630525922 中度到大量生长生长， - 溶血生长，溶血生长 巧克力平板 流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌 102111309043096 生长生长生

10、长 伊红美蓝平板 鼠伤寒沙门菌大肠埃希菌粪肠球菌 140282592229212 生长，无色到琥珀色菌落生长，蓝黑菌落，金属光泽部分抑制 麦康凯平板 大肠埃希菌奇异变形杆菌鼠伤寒沙门菌粪肠球菌 25922124531402829212 生长，红色菌落生长， 无色菌落，迁徒现象部分抑制生长，无色菌落部分抑制 11 种常用培养基的质量鉴定SS 平板 鼠伤寒沙门菌福氏志贺菌粪肠球菌大肠埃希菌 14028120222921225922 生长，无色菌落，有或无黑心生长，无色菌落全部抑制部分或全部抑制 TCBS 平板 霍乱弧菌副溶血弧菌大肠埃希菌 94591780225922 生长，黄色菌落生长，蓝色菌落

11、部分或全部抑制 营养琼脂平板沙保弱平板 福氏志贺菌白色念珠菌大肠埃希菌 120221023125922 中度到大量生长生长部分或全部抑制 罗氏培养基 结核分枝杆菌 H37R大肠埃希菌 2517725922 生长部分或全部抑制 淋病选择性培养基 淋病奈瑟菌奇异变形杆菌表皮葡萄球菌 430964307112228 生长部分抑制部分抑制 11 种常用培养基的质量鉴定测定羊血琼脂平板的性能 培养基质控菌株判定标准生长试验金黄色葡萄球菌 ATCC25923生长溶血反应肺炎链球菌ATCC19615生长，溶血 化脓性链球菌 ATCC6305生长，溶血 杆菌肽敏感（纸片法） 化脓性链球菌 ATCC630510

12、mm，敏感B群链球菌10mm，耐药染色液质量控制 染色液应每周作一次质量控制。用金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 。大肠埃希菌 (ATCC 25922) 作革兰染色液的室内质控。用结核分枝杆菌 H37Ra(ATCC 25177) 对抗酸染色液进行质量鉴定。试剂质控诊断血清的质控 初次使用时应注意：根据使用说明来使用和保存，冻干制品还应注明配成水溶液的日期，应用已知菌效价和特异性进行测定，合格者方可使用。贮存于 4 ，每 3 个月对血清进行一次质控。 试剂名称 阳性对照菌种 阴性对照菌种 监控频率 凝固酶血浆 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天 杆菌肽 A 群链球菌 B 群链球菌 每周 O

13、ptochin 纸片 肺炎链球菌 每周 10% 去氧胆酸钠 肺炎链球菌 每周 三氯化铁（马尿酸钠试验） B 群链球菌 A 群链球菌 每次 常用试剂的质量鉴定 过氧化氢 金黄金葡萄球菌 A 群链球菌 每天 氧化酶 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 每天 甲基红试剂 雷极普罗威登斯菌 阴沟肠杆菌 每周 VP 试剂 粘质沙雷菌 雷极普罗威登斯菌每周 三氯化铁（苯丙氨酸脱氢酶试验） 雷极普罗威登斯菌阴沟肠杆菌每周 常用试剂的质量鉴定 “ X ”因子条状物 嗜沫嗜血杆菌 副流感嗜血杆菌 每周 “V ”因子条状物 副流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每周 “ X+V ”因子条状物 流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌 每周 芽管

14、血清 白色念珠菌 热带念珠菌 每次 常用试剂的质量鉴定 抗菌药物敏感性试验 AST 目的 检出细菌对抗生素的耐药性， 预测临床治疗结果 体外R体内R，对R的结果可以相信 体外S体内S，对S的结果应持怀疑态度 定义：AST 是一个检测细菌耐药性的体外抑菌试验（ART）如果没有细菌耐药性检测治疗过度：用药不当，过度使用抗生素治疗错误：用药错误，危重患者丧失抢救时机增加不必要的副作用增加不必要的费用增加细菌的耐药性降低医疗服务的质量（1）手工试验 1.纸片扩散法（S，I，R） 2.稀释法（MIC） 3.E test（MIC）（2）自动仪器 Vitek，Microscan， Phoenix（3）分子试

15、验 PCR直接检测mecA基因（4）酶试验 Nitrocefin、ESBL检测方 法：纸片法最适合常规实验室使用。其特点是方便、易操作，测定的药物随意可变，灵活性强。重要的是纸片法药敏试验有一套完善的质量控制方法，结果相当可靠。纸片法唯一的不足是中度耐药的菌株会出现问题。肉汤稀释法和琼脂稀释法是把抗菌药物倍比稀释在肉汤或琼脂中定量测定MIC的方法。稀释法可以精确测定一些厌氧菌及苛养菌，而对这些菌纸片扩散法是无能为力的。琼脂稀释法较肉汤稀释法精确的原因在于细菌的生长情况可查，且一套平皿可测多株细菌。这两种方法的缺点的耗时费力。自动化药敏仪目前，有Vitek系统、Microscan系统、Senss

16、titerARIS等。但自动化仪也有一定的局限性。首先药物的选择缺乏灵活性，其次检测一些特殊菌的耐药性时有困难，尤其是快速药敏板，其可靠性不佳。 E-Test法是结合扩散法和稀释法的特点，长塑料条含有连续的呈指数梯度变化的抗菌药物，具有精确、可靠、稳定性好的特点，且各种耐药表型均有良好的效果，唯一的缺点是价格昂贵。 药物敏感试验的质量控制纸片扩散法:每周至少一次;更换药物或培养基是要做质控常用质控菌株:金黄色葡萄球菌ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922 铜绿假单胞菌ATCC27853稀释法(手工):每周至少一次,最好每批实验标准菌株和临床分离菌同时做常用质控菌株:金黄色葡萄球菌ATC

17、C29213大肠埃希菌ATCC25922 铜绿假单胞菌ATCC27853药物敏感试验质量控制培养基：每批做一次质控纸片：每批并每周一次菌悬液浓度标准：为1.5108CFUmlM-H琼脂平皿定量在琼脂扩散法药敏试验中，M-H琼脂厚度是严重影响纸片药敏试验结果的重要因素，琼脂培养基越厚抑菌环直径越小、反之则越大；克服的办法是要在保持水平的平台上（水平仪）定量倾注培养基，这个问题至今未被充分的重视。10cm的平皿应倾注23-25ml的培养基。 抗菌药纸片贮藏 纸片失效是造成药敏结果错误的最重要的原因，必须在-20或更低温度的低温冰箱中保存纸片，近期使用的纸片只需放4冰箱，一周后弃取，更换新纸片。药物

18、敏感试验质量控制连续质控检测1次/天共30天，获30个检测值，如：1、3个值超出范围，可行每周一次质控 2、4个值超出范围，继续做每天一次质控 3、每当试剂、药敏纸片、培养基改变时，应重新行30天的质控 4、每周一次质控时如某周出现一次失控，则应连续做5次质控。零失控时作每周一次质控，否则行连续30次质控药物敏感试验(仪器法)使用厂家规定的标准菌株对相应试剂进行质控每批试剂至少一次当试验结果异常、不稳定，或缺少经验的人员操作时，应增加质控频率。分析后的质量控制包括：结果分析、解释 及报告（包括监测结果的正确报告）合理使用耐药性分析软件1.不可能的结果如MRSA对青霉素类敏感；耐庆大霉素的革兰阳

19、性球菌对其他氨基糖苷类敏感；肠杆菌科耐三代头孢却对氨基、羧基西林或一代头孢菌素敏感此类结果必须找出原因。2.需要修正的结果葡萄球菌、嗜血杆菌或淋病奈瑟菌，如-内酰胺酶阳性时应报告对所有青霉素类耐药。耐林可霉素的葡萄球菌即使出现对克林霉素敏感的结果也应报耐药。耐庆大霉素的革兰阳性球菌即使出现对阿米卡星、奈替米星敏感的结果，因只抑菌而不杀菌，也应报告耐药。同样，托布霉素/阿米卡星也有类似规律。3.提示性药物细菌对此种药物耐药可提示对同类药物均耐药。葡萄球菌对苯唑西林耐药，提示对所有-内酰胺类抗生素均耐药，也会对氨基糖苷类耐药。耐氨苄西林的肠球菌提示对所有青霉素类及亚胺培南耐药。耐庆大霉素的革兰阳性球菌对氨基糖苷类均耐药。大肠埃希菌或克雷伯菌对头孢泊肟、头孢他啶或氨曲南耐药提示会产生超广谱-内酰胺酶（ESBL)。4.需向临床医师解释的结果MRS的体外药敏试验可能出现对某种头孢菌素类、碳青霉烯类或-内酰胺酶抑制类抗生素的敏感结果，但用药无效。具有ESBL的大肠埃希或克雷伯菌即使试验中对某种-内酰胺类敏感也在临床无效，均应向临床解释。外部质量控制体系：室间质量评价临床细菌学实验室室间质量评价目的：了解本实