水稻组培及农杆菌侵染的具体注意事项

1、水稻愈伤组织培养与植株再生(2)(2007-05-14 15:02:48)转载二、水稻愈伤组织培养实验室的建立组织培养的实验室建立可以按照以下的草图进行规划，图例可以按照表1:1415_ 16F、1819图2.植物生物技术实验室平面设计图编号实验室具体设备A洗涤室1.鼓风干燥箱2.储水设备3.水池4.落水架5.工作台B灭菌室6.高压蒸汽灭菌设施7.细菌过滤器C配制室8.冰箱9.物品存放柜10.器械柜11.药品柜12.化学工作台D缓冲室以及工作通道E无菌操作室13.移动载物台14.固定载物台15.烧杯等器械16.超净工作台F鉴定室17.高倍显微镜18.倒置显微镜19.实体显微镜20切片机21.恒

2、温箱G培养室22.固定架设备23.控光设备24.制冷设备H移栽驯化室表1.实验室中图例说明（二）、培养基的配制配制培养基母液：按照MS培养基成分表，配制分别配制培养基的母液。MS培养基母液种类成分规定用量（mg/L）扩大倍数称取量mg母液体积配制1L培养基吸取量（ml）旦一主MgSO4-7H2OCaCl2-2H2ONH4NO3KNO3KH2PO43.7x1024.4x1021.65x1031.9x1031.7x1021003.7x1044.4x1041.65x1051.9x1051.7x104100010大量兀素微量元素MnSO4-4H2O ZnSO4-7H2O Na2MoO4-2H2O H3

3、BO3 CUSO4-5H2O KI22.38.60.256.20.0250.835001.115x1044.3x1031.25x1023.1x10312.54.15x102100050CoCl26H2O0.02512.5铁盐Na2EDTA2H2OFeSO47H2O37.327.81003.73x1032.78x103100010有机物质肌醇烟酸维生素B6维生素B1氨基乙酸1000.50.50.12.01001.0X10450501.0X1022.0X102100010表2. MS培养基成分表配制与分装：取1000ml烧杯一只，加大量元素100倍母液10ml,微量元素500倍母液50ml,铁盐1

4、00倍母液10ml, 有机物质100倍母液10ml。此外，根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素，细胞分裂素及蔗 糖等，然后加水至1000ml，待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8，最后加入琼 脂粉6.5g，如用琼脂条，则要加8g。将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全融化，补加蒸馏水 至 1000ml。灭菌把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。设置灭菌参数为121C, 20min，开始灭菌。 培养基经高压蒸汽灭菌后分装于无菌的100mL三角瓶中,每瓶约40mL，用4层旧报纸封口，培养期间 瓶口贴上约3/4面积的透明胶纸以保持适当程度的有利

5、于再生的通气状态。分装时要避免把培养基倒 在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染10。（三）、培养条件光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一 种诱导反应。光照强度为20003000lx，每日光照1012h。温度：一般采用1626C的恒温条件进行，而培养基的胨力强度为160g/cm2。瑚湿度：湿度应该较大，以免引起培养基干缩。（四）、水稻愈伤组织培养外植体的选择胚轴取材方法是在超净台上首先剥掉籽粒颖壳，用0.1%升汞溶液消毒20min，无菌水冲洗45次， 再消毒5 min，无菌水冲洗5次，接种在发芽培养基上发芽，35d后，再在超净台上将已发芽的胚 轴

6、切下，接种于诱导培养基上培养。水稻成熟胚愈伤组织的诱导将水稻成熟种子去壳，经70%乙醇处理5min后用0.1%氯化汞溶液浸泡30min，再用无菌水漂洗3遍， 放入26C2C培养过夜，次日再用70%乙醇处理5 min，之后用0.1%氯化汞溶液浸泡5 min，再用无 菌水漂洗3遍。将消毒的稻种分别接种到不同的诱导培养基中，26C2C黑暗条件下培养30dU2。愈伤组织的继代培养愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于养分的枯竭，水分的散失，组织代谢产物的积累，影响愈 伤组织生长，因此必须将组织转移到新的培养基上。一般在25-28C下进行固体培养时，每隔4-5周 进行一次继代培养。水稻愈伤组织的分化挑选

7、生长良好、结构致密的愈伤组织，先转到分化培养基上，26C2C黑暗条件下培养2周。然后转 至26C2C光照条件下培养，光强为400mol/ii-s，每日光照16h,培养3050 d，诱导不定芽，将产 生绿芽的组织转至以1/2MS为基本培养基的无激素的壮苗培养基中，26C2C光照条件下培养，使 其生根长成完整植株12。三、讨论水稻胚性愈伤的诱导是水稻遗传转化中的重要环节，胚性愈伤的状态直接影响着遗传转化频率，所以 提高良好生长状态的胚性愈伤的数量是提高转化频率的关键13。为了提高水稻愈伤的出苗率，有采用 干燥处理，辐射处理，添加铜14-15、银元素，添加脯氨酸，添加MET(多效唑)和添加活性碳等方

8、法。 16理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。原因是遗传 因素即继代培养中通常出现染色体紊乱。水稻成熟胚愈伤组织的诱导和再生是组织培养中的两个关键问题，它们涉及到外植体的脱分化过程和 愈伤组织的再分化过程17。影响水稻胚性愈伤组织形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、 渗透压、外植体来源、固化剂、培养基其它成份以及温度、光周期和继代时间等多个方面，其中材料 的基因型和外源激素的种类、浓度和配比是最主要的因素18。植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重 要的作用。光照是离体培养中比较复杂的调节因子

9、，光照时间,强度以及光质对器官分化均有影响。因为光照容易 引起愈伤组织的老化坏死，所以对后续实验有很大的影响19。认为除选择了合适的培养条件外，也与我们使用的是无菌苗作材料很有关系。因为通过无菌苗的培养， 可以提高烟草细胞对离体培养环境的适应性，实际上它相当于植物组织和细胞培养过程中材料的预处 理，预处理能增进细胞活力，从而提高存活率。20四、参考文献1、Hiei Y ,Ohta S , Komari T ,et al Efficient transformation of rice (Oryza sativa L) mediated by agrobacterium and sequence

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