反向遗传学以及其相关技术

1、关于反向遗传学及其相关技术第一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月一、概述（一）遗传研究的二条途径1、表里：正向遗传学研究杂交或诱变表型观察遗传规律确定存在的基因及数目基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。第二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2、里表：反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。第三张，PPT共七

2、十五页，创作于2022年6月（二）RNA病毒的反向遗传学 采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。 能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆，一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。 RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。 第四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RNA病毒的反向遗传操作 RT-PCR构建RNA病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰 与RNA聚合酶启动

3、子结合 体外转录病毒RNA 转录物RNA感染哺乳动物细胞 拯救到活病毒 拯救病毒的表型变化 病毒基因组的表达、调控、致病机理、 病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等第五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月单正股RNA病毒：RNA聚合酶+mRNA + +中间型 结构蛋白+子代正股RNA单负股RNA病毒：RNA聚合酶 +结构蛋白子代负股RNA逆转录病毒：RNARNA/DNA中间体逆转录酶DNA/DNA宿主子代RNA正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒?第六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（三）真核生物的反向遗传学采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。研究手段包括基

4、因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。第七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组2、基因的位点突变3、基因沉默基因敲除第八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组第九张，PPT共

5、七十五页，创作于2022年6月完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除。条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除条件敲除特定组织/时间基因敲除基因敲除第十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月1）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体 重组DNA转入受体细胞核内 筛选目的细胞 转基因生物重组载体的类型：a)替换性载体系统：包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。b)插入性载体系统：插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段。第十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月用替换型（a）或插入型（b）载体进

6、行完全基因敲除实验第十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2）Res同源重组系统源于噬菌体Res重组酶的重组系统Ha 和Hb: 同源重组区域 Pa 和Pb: 引物位点sm: 筛选标记Red 同源重组技术用于基因打靶第十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月3）Cre-LoxP同源重组系统 源自P1噬菌体的重组系统 属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。该系统由P1噬菌体的Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre重组酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP位点：由2个13bp的

7、反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。第十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Cre酶 Cre酶 Cre酶 Cre重组酶13bp的反向重复序列 第十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Cre-LoxP 重组系统的特点CreCre Cre 重组酶所催化的是一个可逆的重组事件 Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与介导两个同向LoxP位点之间序列的插入/缺失（下左）介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）介导两条含LoxP位点DNA链的交换或染色体易位。 第十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Cre-Loxp gene knock-out system第十七张，PP

8、T共七十五页，创作于2022年6月4) 高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。第十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月模式动物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系，白色，易产生免疫缺陷 第十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2、基

9、因的位点突变1）点突变TILLING技术TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。 先用化学诱变剂(甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析。第二十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（建池）第二十一张，PPT共七十五页，创作于2022

10、年6月第二十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月TILLING特点： TILLING技术属于高频率点突变和PCR筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因，复等位基因等具有独特的技术优势。可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体。不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养。需要知道所研究基因的序列。第二十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2）随机插入突变T-DNA插入突变 以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可

11、以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。构建T-DNA载体转化突变体的筛选及遗传分析分离T-DNA 插入位点的侧翼序列基因的定位、结构与功能分析。第二十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月T-DNA法敲除植物基因及突变体筛选： a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段 引物。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b. PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。第二十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月T-DNA插入特点：不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。隐性突变与显

12、性突变：隐性表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性可以在转化体中直接观察到（基因激活）。某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。染色体重排：突变体表型与T-DNA 插入无关。效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。第二十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突变体的基因组DNA文库中筛选到突变的基因

13、，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。第二十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月转座子插入特点：插入的是完整的元件，便于分析。可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构。通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。可以应用于转化效率不高的植物。第二十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月转座子系统Ac/ Ds 系统

14、 由自主性元件（Ac）和非自主性元件（Ds）构成。Ds元件能够在Ac编码的转座酶的作用下移动，去除Ac元件可使其自身不能转座。 通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序列可以重新移动。因此，Ac/Ds 转座子插入系统只需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座源即可。第二十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。修饰的Ac/Ds转座子系统第三

15、十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月增强子陷阱( enhancer trap )：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱第三十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Mu转座子系统转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。可以在拟删除基因两侧各插入一个mini-Mu转座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。

16、这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移。特点：不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可载体构建迅速，技术简单载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。第三十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月三、基因沉默技术 反义RNA RNA干扰（RNAi）第三十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月反义RNA技术反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制mRNA的翻译或被RNA酶识别降解。2、反义RNA是与mRNA的非编码

17、区结合，引起mRNA构象的变化，从而抑制其翻译。3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。第三十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（一）概念RNA干扰(RNA interference，RNAi)：与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种序列特异性转录后基因沉默现象。RNA干扰第三十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月基因沉默转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)基因沉默第三十六张，PPT共七十五

18、页，创作于2022年6月转录水平的基因沉默（TGS）是指基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： 基因及其启动子甲基化：通常发生在DNA的CG序列的碱基上，该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。 同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 第三十七

19、张，PPT共七十五页，创作于2022年6月后成修饰作用导致的基因沉默：指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。第三十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6

20、月转录后水平基因沉默（PTGS）则是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在的现象。引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：共抑制：由Napoli在转CHS基因的矮牵牛花中发现，普遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。 具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无mRNA积累，是典型的转录后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。 第三十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月基因压制：C

21、ogoni等首先在粗糙脉孢霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态mRNA大量减少。 RNA干扰：指将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA (dsRNA) 导入细胞后并被切割成2123个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致其降解，从而产生相应的功能表型缺失。 第四十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RNAi 一种新的遗传工具RNAi是植物、果蝇、线虫和包括哺乳动物在内的许多生物抵抗病毒感染

22、和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体，从而研究该基因的功能. 这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达，或者由蛋白过量表达引起的疾病。 第四十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月(二)、RNA干扰的发现 1994年 Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。共抑制现象(cosuppression) 上世纪90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组在对矮牵牛(petunias)的研究中发现:转基因的植株不仅没有新基因表达，反而

23、使原有的色素基因也受到了抑制。第四十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因实验中发现：反义RNA与正义RNA（对照）都能切断par-1基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀丽新小杆线虫转基因实验反义RNA与正义RNA？反义RNA -与靶核酸(如mRNA或有义DNA)链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。 正义RNA-与mRNA对应的RNA分子。第四十三张，PPT共七十五页

24、，创作于2022年6月RNA干扰的发现 1998年，Fire和Mello（美）首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起：将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干扰。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Na

25、ture. 1998,391:806-811.第四十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. （对照，缺mex-3 ，不着色）(B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). （正常野生型，紫）(C) Embryo from parent injected with purif

26、ied mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. （野生型+反义RNA，浅紫）(D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA

27、and in situ probes were largely non-overlapping.) （野生型+双链RNA，不着色）Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization （原位杂交）of 4-cell stage embryos. 第四十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月“沉默”是金Fire与Mello获2006年诺贝尔奖第四十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月在1999年一年

28、内,发现RNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。2000年提出RNAi作用机制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-332001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，2001，411（6836）：494498RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。第四十七张，PPT共七十

29、五页，创作于2022年6月2002年5月，Lindenbach(美),双链RNA艾滋病病毒细胞减少艾滋病病毒基因表达90%以上。2002年7月,Novina等用RNAi技术实现了HIV1病毒的阻抑。2002年7月, McCaffrey(美)等人, 双链RNA+肝炎病毒-标志基因鼠肝脏抑制标志基因的表达/肝炎病毒基因的表达。利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。第四十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月共抑制、基因压制和RNAidsRNA降解靶mRNA抑制靶基因的表达。均属于PTGS！dsRNA导入线虫RNAi ；dsRNA注射线虫体腔RNAi ；dsRNA浸润线虫/dsRNA的

30、工程菌喂养线虫RNAi。dsRNA导入植物RNAi；同样，dsRNA注射植物韧皮部RNAi；吸附500bp基因片段的金属片插入植物侵入点组织发生RNAi。RNAi普遍存在于各种生物中,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。第四十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（三）、RNA干扰的机制 dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链。Dicer：属于RNase 家族的一员，是dsRNA的特异性核酸内切酶，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA。siRNA (small interfering RNA) ：小干扰RNA

31、，是长度为21-23个nt大小的双链RNA，为RNAi的关键效应分子。名词解释：第五十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Dicer contains two RNAse III domainssiRNAslong dsRNA第五十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月siRNA第五十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RISC(RNA-inducing silencing complex)： RNA诱导沉默复合物，是一种核蛋白复合物，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-dependent RNA polymerases）： 依赖RNA的RNA聚合酶，是RN

32、Ai的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递。第五十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P核酸外切酶 解旋酶 核酸内切酶 第五十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：第一步（起始阶段）较长dsRNA在ATP参与下，被RNase的特异核酸酶切割加工成2123nt的，由正义和反义链组成的小干扰RNA（small inte

33、rfering RNA，siRNA）。 siRNA的两条单链末端为5-磷酸和3-羟基，且3端均有2个突出的核苷酸。 Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。步骤第五十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第二步（效应阶段）siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对

34、应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。第五十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RNAi的放大效应机制siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。第五十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Gisela

35、 Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.异常的单链RNA依赖RNA的RNA聚合酶特异性核酸内切酶RNA诱导沉默复合物第五十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性：只有dsRNA才能诱导产生RNAi；只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解；dsRNA不得短于21个碱基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑制凋亡； RNAi具有高效性： RNAi抑制基因表达

36、具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；RNAi干扰的几个重要生物学特征第五十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月RNAi具有很好的稳定性：siRNA分子3端有突出的非配对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在3- 4d，以3端悬垂TT碱基的双链RNA尤为稳定，半衰期远长于反义寡聚核苷酸。 RNAi的可传播性和遗传性：RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。RNAi效应的依赖性：只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生

37、短暂的沉默反应。RNAi作用迅速，mRNA快速降解；第六十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月miRNA及其作用机制miRNA(microRNA) : 微小RNA，指长度约2125nt的小分子单链RNA，位于基因组的非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平上对基因表达进行调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。miRNA基因的表达具有特定模式: 阶段特异性和组织特异性，在不同组织中表达有不同类型的miRNA，在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达。第六十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月miRNA的作用机制第六十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6

38、月相同点:长度都约22 nt 左右；同是Dicer产物，因此具有Dicer产物的特点；二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在；同是RISC的组分。miRNA与siRNA比较第六十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月来源不同：siRNA来源于转基因或病毒RNA，由长dsRNA转变而来；miRNA来源于内源转录本，是细胞内RNA的固有组分之一，由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来；结构不同：siRNA主要以双链形式存在，其3端存在2个非配对的碱基，通常为UU；miRNA主要以单链形式存在；对靶RNA 的特异性不同： siRNA与靶mRNA完全互补配对结合；miRNA与靶RN

39、A并不完全互补，存在错配现象。靶序列有一个核苷酸突变，就会影响到siRNA的作用功能，但不会影响到miRNA的功能；作用形式不同：siRNA主要在转录后通过降解mRNA发挥作用，而miRNA只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。不同点:第六十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（四）、RNA干扰的研究方法 一般技术路线第六十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月（五）、RNA干扰的应用 1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳

40、动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 第六十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2.病毒性疾病的治疗 使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受体， HIV-1的辅因子）进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV

41、-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。艾滋病第六十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2.病毒性疾病的治疗 Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染

42、core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。 HBV（乙肝病毒）第六十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2.病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。 HCV（丙肝病毒）第六十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月