第十六章抗生素类药物的分析

1、第十六章抗生素类药物的分析 定义： 抗生素是生物（动物、植物和微生物）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），在低微浓度下有选择性地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。来源： 生物合成（发酵） 化学合成或半合成第一节 概 述 一、特点1. 化学纯度低：同系物多、异构体多、降解产物多2. 活性组分易变异：菌株变化、发酵条件改变3. 稳定性差（本身分子结构不稳定，易分解，使疗效降低或失效甚至产生毒副作用）二.分类 内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类) 氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星) 四环素类(四环素、金霉素、土霉素) 大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素) 多烯大环类

2、(制霉菌素、两性霉素B) 多肽类(多黏菌素、放线菌素) 酰胺醇类抗生素（氯霉素） 抗肿瘤抗生素（有丝裂霉素、盐酸多柔比星） 其它抗生素：盐酸克林霉素、盐酸林可霉素等。1. 根据产生抗生素的生物来源分类2. 根据抗生素的作用对象分类3. 根据抗生素的作用机制分类4. 根据抗生素的化学结构分类（一）鉴别1. 理化方法（1）官能团显色反应（2）光谱法 （3）色谱法2. 生物学法三、抗生素的质量分析1.影响药物稳定性的项目 酸碱度、水分等。2 影响药物纯度的项目 溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属、吸光度等。 3. 与临床安全性密却相关的项目：异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、

3、无菌等。4. 其它 ：如注射用普鲁卡因青霉素还规定了悬浮时间与抽针试验等。（二）检查青霉素钠 Ch.P.（2010） 结晶性 酸碱度 溶液的澄清度与颜色 吸光度 有关物质 青霉素聚合物 干燥失重 可见异物 不溶性微粒 细菌内毒素 无菌（三）含量测定方法1. 抗生素微生物检定法 药典附录测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点与临床要求一致灵敏度高、用量少适用范围广，可用于未知药物缺点操作繁琐、测定时间长、测定误差大2. 理化方法以理化方法测定抗生素的效价适用于纯度较高的结构确定的抗生素优点1. 准确度高2. 简单、快速不一定代表生物效价易受杂质干扰缺点3. 抗生素活性表示方法以效价表示，即指每毫升或每毫

4、克中含有抗生素的有效成分的多少。磺苄西林钠 Ch.P.（2010）【含量测定】 精密称取本品适量，用灭菌水制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录 A）测定。1000磺苄西林单位相当于1mg的C16H18N2O7S2。 第二节 -内酰胺类抗生素 主要药物： 青霉素类 头孢菌素类青霉素类头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环 -内酰胺环青霉素类6-氨基青霉烷酸（6APA）*手性C酸性不稳定酰胺侧链青霉素（苄青霉素） 包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。氨苄西林（氨苄青霉素）.阿莫西林（羟氨苄青霉素）.磺苄西林钠（磺苄青霉素钠）头孢菌素类7-氨基头孢菌烷酸（7ACA）*手性C酸

5、性酰胺侧链不稳定UV头孢氨苄.头孢羟氨苄头孢拉定头孢噻吩钠一、性质1. 酸性 游离羧基酸性，易与碱成盐。2. 旋光性 - 手性碳3. 紫外吸收特性 青霉素母核无吸收，但通常其侧链有吸收；头孢菌素母核O=C-N-C= C，在260nm处强吸收。214. 稳定性 -内酰胺环为四元环，张力大，且酰胺键易水解，不稳定。 稳定性与含水量和纯度相关。 在水溶液中，易受酸、碱、酶、金属离子或氧化剂的影响，发生水解和分子重排。23温度氧化剂（头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%）（青霉素钠水溶液30 24h失活56%）Cu2+、Pb2+、Hg2+、Ag+24不同pH条件下青霉素钠降解情况24半衰期(h) 2 3

6、 4 5 6 7 8 9 10 11pH青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸pH2100青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2二、鉴别 本类药物的鉴别试验，国内外药典中主要采用的方法为IR、HPLC、TLC法。（一）色谱法1. TLC 与对照品比较Rf值与斑点颜色2. HPLC 与对照品比较tR值（二）光谱法1. IR法特征官能团：酰胺-内酰胺2. UV法青霉素钠1. 羟肟酸铁反应 内酰胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反应头孢哌酮 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液3ml，振摇溶解后，放置5分钟

7、，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。2. 茚三酮反应注射用头孢拉定 Ch.P.（2010）TLC鉴别显色剂: 茚三酮3. 三氯化铁反应 酚羟基 偶合呈色三氯化铁 头孢羟氨苄 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品适量，加水适量超声使溶解并稀释制成每1ml中约含的溶液，取溶液1ml，加三氯化铁试液3滴，即显棕黄色。4. 各种盐的反应 焰色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌黄 Na+ 焰色紫色 + 0.1%四苯硼钠 + Ac白 K+K+、Na+反应（一）聚合物 1. 定义 高分子杂质指抗生素药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在10005000道尔顿，个别可至10000道尔顿。 分为内

8、源性和外源性杂质。三、检查34例 青霉素钠 【检查】青霉素聚合物 青霉素钾【检查】青霉素聚合物 阿莫西林 【检查】阿莫西林聚合物（青霉噻唑蛋白 + 青霉素、青霉噻唑多肽类） 头孢他啶 【检查】头孢他啶聚合物 头孢曲松钠 【检查】头孢曲松聚合物 头孢哌酮钠 【检查】头孢哌酮聚合物外源性杂质：包括蛋白、多肽、多糖类杂质或其与抗生素的结合物。主要来于自发酵工艺。内源性杂质：自身聚合物。生产或贮藏过程中产生。 2. 来源3. 高分子杂质的分类 （1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽 （2）青霉素聚合物 （3）头孢菌素聚合物 364. 分析方法 反相色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法）聚合物检

9、查方法： 多用分子排阻色谱法。即根据分子量差异进行分离的凝胶色谱法。 凝胶色谱具有分子筛的作用，让药物分子自由的进入凝胶颗粒表面，而高分子杂质被排阻，不能进入颗粒内部；色谱过程中凝胶对药物的吸附作用大于对高分子杂质的吸附作用，可使高分子杂质与药物分离。3839高分子杂质定量测定法： 1. 主成分自身对照法 2. 面积归一化法3. 限量法4. 自身对照外标法 -内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。 在以水，0.01%SDS或0.5%葡萄糖溶液作为流动相时，-内酰胺类抗生素可缔合形成表观分子量较大的缔合物，该缔合物在Sephadex G

10、10 凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质一样，表现为单一的色谱峰。利用这一特点，在Sephadex G 10 凝胶色谱系统中制定了新的定量方法-自身对照外标法。41例1 青霉素钠 Ch.P.（2010） 【检查】青霉素聚合物 照分子排阻色谱法（附录 H）测定。 填充剂 葡聚糖凝胶G-10（40120m） 流动相磷酸盐缓冲液（） 2HPO42PO4（61:39) 流动相B 水 流速 波长 254nm n700（按蓝色葡聚糖2000计） 杂质限量0.08% 头孢呋辛酯 - HPLC 异构体 规定峰面积大小比值有关物质 主成分自身对照法（二）异构体和有关物质（三）2-乙基己酸 -内酰胺环制备过程中

11、，采用游离酸与2-乙基己酸钠作用生成钠盐，并在2-乙基己酸中直接析出钠盐结晶，易残留2-乙基己酸。检查方法：GC（杂质对照品法） 头孢哌酮钠 Ch.P.（2010）【检查】吸光度 取本品约1g精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在430nm的波长处测定吸光度，不得大于。（四）吸光度（五）有机溶剂 部分药物需检查有机溶剂。（六）结晶性 固态物质分为结晶质和非结晶质两大类，可用下列方法检查物质的结晶性。（1）偏光显微镜法； （2）X射线粉末衍射法。（七）水分 影响稳定性的重要因素。（八）其他特殊杂质头孢克洛含量测定 Ch.P.（2010）【含

12、量测定】填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 磷酸二氢钾溶液乙腈（928） （pH3.4)对照品 头孢克洛（含头孢克洛-3-异构体） 两者分离度应大于四、含量测定（一）高效液相色谱法（二）碘量法原理： 内酰胺类不直接与碘反应； 内酰胺类水解产物可与碘发生定量反应。反应分两步进行：应：严格控制反应条件 采用标准品平行操作 （2）氧化-还原反应（无固定量关系，易受温度、pH值和时间等因素影响）（1）水解反应（按化学计量进行） 青霉素中本身含有降解杂质，或样品中含其它杂质，可能消耗碘，碘挥发也带来损失。 以未经水解的样品做空白。方法：供试液+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴对照液

13、+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴 要求做空白及应与标准对照平行测定测定条件（1）必须碱性水解完全后才能测定（2）该法用不加碱水解的样品作空白，可消除降解产物及其他耗碘杂质的干扰（3）1mol样品消耗4mol I2，灵敏度高（4）碘与青霉噻唑酸作用以，温度在2426为好（5）采用对照品平行测定 （三）汞量法水解水解青霉胺络汞1. 原理 青霉素分子不与汞盐反应，但其碱水解产物青霉噻唑酸及继续水解产物青霉胺都可与汞盐定量反应，根据消耗的汞盐量可计算青霉素的含量 2. 测定方法（1）样品测定（2）降解物测定 3. 测定条件（1）第二次突跃为终点，反应摩尔比11（2）水解必须完全

14、（3）该法用不加碱水解的样品作空白，可消除降解产物的干扰（4）本法的优点是不需要对照品对照 （四）硫醇汞盐法325-345nm处最大吸收（咪唑）（五）酸碱滴定法过量的NaOH以盐酸滴定酸碱滴定法（水解后剩余滴定法） 1. 原理 青霉素或头孢菌素可被碱水解，并且碱性水解定量完成。 2. 测定条件（1）所用的水必须是新沸的，临用时用氢氧化钠液调至pH8（2）测定中避免吸收空气中的二氧化碳 60第二节 氨基糖苷类抗生素一、化学结构与性质1. 化学结构碱性环己多元醇61链霉素streptomycin（碱性环己多元醇）链霉胍链霉糖N-甲基葡萄糖胺（氨基糖）链霉双糖胺庆大霉素gentamycin（复合物）

15、（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺脱氧链霉胺（碱性环己多元醇）庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R1、R2=CH3 R3=H 庆大霉素C2 R1=CH3 R2=R3=H 庆大霉素C1a R1、R2、R3=H 庆大霉素C2a R1= R2=H R3=CH365巴龙霉素paromomycin（碱性环己多元醇）脱氧链霉胺D-核糖D-葡萄糖胺（氨基糖）巴龙霉糖（氨基糖）巴龙胺巴龙二糖胺66奈替米星netilmicin脱氧链霉胺（碱性环己多元醇）（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺672. 性质（1）溶解性与碱性溶解性 水溶性（多-OH）碱性 -NH2 可与酸成盐 临床上多用硫酸盐68（2）旋光性 手性

16、C硫酸庆大霉素硫酸巴龙霉素硫酸卡那霉素50mg/ml水溶液69（3）稳定性链霉素稳定OH-葡萄糖胺链霉糖OH-麦芽酚反应坂口反应坂口反应麦芽酚反应71链霉素（4）UV链霉素max=230nm72（一）茚三酮反应 -氨基醇、羟基胺类蓝紫色二、鉴别试验茚三酮-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式+缩合74例 硫酸小诺霉素 Ch.P.（2010） 【鉴别】（1）取本品约5mg，加水溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶ml，在水浴中加热5分钟，即显蓝紫色。75（二） Molisch反应水解或蒽酮761. -萘酚呈色原理2. 蒽酮呈色原理例 阿米卡星 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取

17、本品约10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即显蓝紫色。78（三） N-甲基葡萄糖胺反应乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色（Elson-Morgan反应）水解对二甲氨基苯甲醛H+Elson- Morgan反应OH- (缩合)乙酰丙酮例 硫酸新霉素 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。（四）麦芽酚（Maltol）反应链霉素特征反应H+紫红色82Ma

18、ltol反应H+ Fe3+分子重排麦芽酚83例 硫酸链霉素 Ch.P.（2010） 【鉴别】（2）取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液（取硫酸铁铵，加硫酸溶液5ml使溶解） ，即显紫红色。84（五）坂口（Sakaguchi）反应链霉胍特有反应水解橙红色次溴酸钠8-羟基喹啉（或- 萘酚）85Sakaguchi反应+例 硫酸链霉素 Ch.P.（2010） 【鉴别】（1）取本品约，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。（七）色谱法TLC、HPLC法（八）光谱法 IR 、U

19、V法（六）硫酸盐反应 多为硫酸盐，显硫酸盐的鉴别反应。 见Ch.P. （ 2010 ）附录。例 庆大霉素 BP（2010） 取硫酸庆大霉素10mg，加水1ml和40%的硫酸溶液5ml，在水浴中加热100分钟，冷却，用水稀释至25ml。取该溶液进行紫外扫描，在240-330nm范围应无最大吸收。三、有关物质及组分分析（一）有关物质（二）硫酸盐测定 EDTA测定法或HPLC法（三）组分测定90庆大霉素C1 、C2 、C1a*对微生物的活性无明显差异*毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定各组分的相对百分含量Ch.P.、BPUSPHPLC法庆大霉素C组分测定C1 25%-50%

20、C1a 15%-40%C2a + C2 20%-50% 要求：方法：HPLC庆大霉素本身无紫外吸收，可衍生化max = 330nmpH10.4巯基醋酸HPLC（紫外检测） USP(29)、Ch.P(2000)93942. 离子对HPLC法（电化学检测器） BP（2005）3. HPLC法（蒸发光散射检测器） Ch.P.（2010）硫酸庆大霉素 Ch.P.（2010）【检查】庆大霉素C组分 照高效液相色谱法（附录 D）测定。填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶(pH0.88.0)流动相 三氟醋酸-甲醇（92:8）检测器 蒸发光散射检测器标准品 庆大霉素、小诺霉素 小诺霉素与庆大霉素各组分峰应满足分离度要

21、求。96硫酸庆大霉素C组分的HPLC-ELSD色谱图庆大霉素标准品（A）及其样品（B）的HPLC-ELSD色谱图 1-硫酸盐；2-庆大霉素C1a；3-庆大霉素C2；4 庆大霉素C2b；5-庆大霉素C2a；6-庆大霉素C1 ；7-未知杂质 AB 蒸发光散射检测器（Evaporative Light-scattering Detector）是质量型检测器，只与待测物质的量相关，无所谓其光学性质或电化学性质。因此对于许多没有光学吸收特征的生物性物质的检测，蒸发光散射检测器提供了新一代的检测方法。 三、含量测定 主要用微生物检定法。部分药物采用HPLC法。 例 硫酸链霉素 Ch.P.（2010）【含量

22、测定】精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录 A）测定， 1000链霉素单位相当于1mgC21H38N7O12。第四节 四环素类抗生素一、化学结构与性质（一）化学结构ABCD432156789101112碳原子编号四环素（TC）tetracycline102金霉素 （CTC）chlortetracycline氯四环素103土霉素 （OTC）oxytetracycline氧四环素104多西环素 （DOTC）doxycycline强力霉素脱氧土霉素105美他环素（METC） metacycline106两性弱酸性、UV、旋光性弱碱性二甲胺基

23、弱碱性酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性1. 酸碱性（二）性质 两性溶解性2. 旋光性 手性C3. UV 共轭体系4. 与金属离子生成有色配位化合物酚羟基、烯醇基Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+109有强烈荧光110（1）差向异构化5. 不稳定性 111土霉素、多西环素不易差向异构化112（2）降解性质A. 酸性降解113114pH2pH2115B. 碱性降解（荧光）二、鉴别（一）HPLC法例 盐酸土霉素 Ch.P.（2010）【鉴别】 （2）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致（二）TLC法固定相：硅藻土 EDTA：克服痕量金属离子存在引起 的

24、拖尾现象。黏合剂： EDTA+甘油流动相：含EDTA 例 盐酸土霉素 Ch.P.（2010）【鉴别】（2）取本品与土霉素对照品，分别加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液；另取土霉素与盐酸四环素对照品，加甲醇制成每1ml中各含1mg的混合溶液，照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述三种溶液各1l，分别点于同一薄层板上，取4%乙二胺四醋酸二钠溶液（）5ml，加至乙酸乙酯-三氯甲烷-丙酮（2:2:1）200ml中为展开剂，展开后，晾干，用氨蒸气熏后，置紫外光灯（365nm）下检视，混合溶液应显示2个完全分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的荧光强度及位置应与相应的对照品溶液的主斑点相同。（三）IR 法（四

25、）UV 法（五）化学鉴别法1. H2SO4反应例 盐酸金霉素 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约，加硫酸2ml即显蓝色，渐变为橄榄绿色，加水1ml后，显金黄色或棕黄色。2. 三氯化铁反应酚羟基与三氯化铁反应。例 盐酸四环素 Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约，加硫酸2ml，即显深紫色，再加三氯化铁试液1滴，溶液变为红棕色。 三、检查（一）盐酸四环素中有关物质 4-差向四环素 脱水四环素 差向脱水四环素 土霉素 盐酸金霉素检查方法：HPLC （加校正因子的主成份自身对照法）例 盐酸四环素 Ch.P.（2010）【检查】有关物质 取本品适量，加/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含的溶液，作为供试品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中， 加盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液和对照溶液各10l，分别注入液相色谱仪。记录色谱图至主成份保留