修改选修三12《基因工程的基本操作程序》

1、ECOR1限制酶Sma1限制酶1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质. RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条

2、链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。： 能转录相应的信使RNA， 能编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子与RNA聚合酶结合位点2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋

3、白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_ _和具有调控作用的_ _区组成的3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤：有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细

4、胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因一：目的基因的获取供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。(一)、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增获取目的基因3、人工合成目的基因1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入

5、到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库 基因组文库（全部）部分基因文库（如:cDNA文库）（1）.基因文库基因组文库的构建（2）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切割一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶 cDNA文库的构建-反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所

6、需的基因。基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方法 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 聚合酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA双链复制2、利用PCR技术扩增目的基因前提：一段已知目的基因的核苷酸序列

7、，以便根据这一序列合成引物条件：_、 _、_ 、 _.方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链利用PCR技术扩增目的基因PCR(多聚酶链式反应)思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为

8、循环次数)（24-1）2=30PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子3.人工合成法DNA合成仪推测推测合成1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因（序列已知）2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因3、过程：3、人工合成法： 基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪直接用化学方法人工合成。1.用一定的

9、_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建 基因表达载体的构建 基因工程的核心1、目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终

10、获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料:载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制

11、原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意：(三)将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 动植物细胞、大肠杆菌、 土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达 方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌

12、转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞 吸收DNA分子1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法： 农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理： 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达过程：优点：经济有效（2）基因枪法： 利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 钨粉粒子和金粉粒子单子叶植物常用的基因转化法，成本较高（3）花粉管通道法： 在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴

13、加DNA（含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国独创，简便经济，转基因抗虫棉。2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射技术 程序：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 常用菌:大肠杆菌 转化方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法D

14、NA分子杂交分子杂交抗原-抗体杂交（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（DNA分子杂交）过程:转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段方法DNA分子杂交技术（DNA/DNA）变性变性归纳步骤DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链

15、具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 P15思考与探究2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法: 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。（抗原-抗体杂交）过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA（mRNA分子杂交）变性方法分子杂交技术（DNA/RNA）（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质

16、方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养（二）、鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳步骤获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法人工合成目的基因构建基因表达载体（核心）目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法 感受态细胞吸收DNA分子目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：抗虫，抗病，活性等归纳: 基因工程的基本操作程序思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导

17、入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞

18、器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）

19、培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）aa1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是

20、A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶练习4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料练习5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因

21、与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达练习6、下列属于获取目的基因的方法的是( )利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.7.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是： A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接8. 有关基因工程的叙述正确的是：A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料9.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因10.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法12、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（ ）A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA 12、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（ ）A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的