细胞免疫染色及畸胎瘤切片制作流程

1、细胞免疫染色及畸胎瘤切片制作流程第一部分多能干细胞免疫染色过程铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照提纲铺细胞ES细胞或iPS细胞的密度要求无滋养层细胞较好传代后至克隆形态良好，密度适中。通常传至24孔板中。因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。Oct4/DAPI铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照提纲材料细胞的固定流程把细胞固定在4PFA中，室温放置30min 4多聚甲醛（4PFA, Paraformaldehyde）固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮2次 的PBS配制（），100mL PBS加4克多聚甲醛。由于多聚甲醛难溶于水，需

2、用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下。 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照提纲细胞的荧光染色材料流程阳性染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性阴性染色对照：染色呈阳性时，证实染色的特异性一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核抗体稀释液：稀释抗体封闭液：封闭非特异性反应洗涤细胞透膜（仅限染核抗体）一抗孵育二抗孵育染核定位（Hochest）细胞的荧光染色材料阳性染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。

3、一抗：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。Hoechst：英文名称：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分装后于-20保存；常用的可置于4 ，染色时以1XPBS 1000倍稀释。 抗体稀释液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS； 4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。封闭液：含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；尽量现用现配，因含蛋白

4、成分，容易变质，长菌。细胞的荧光染色流程所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。“洗涤”指将平板置于摇床上摇洗35分钟 把细胞固定在4PFA中，室温放置30min 1X PBS 洗涤2次 抗体稀释液洗涤两次 无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）(此步仅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白) 1X PBS洗涤1次 封闭液封闭细胞，室温，1h 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4 放置过夜(以24孔板为例，一抗的体积：200ul/孔) 细胞的荧光染色流程吸弃一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in

5、 PBS）洗涤细胞35次将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置1h; (以24孔板为例，二抗的体积：200ul/孔) 注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！ 用PBT洗涤3次，约5min/次 用PBS洗涤两次，5min/次 再用4PFA室温固定30min 最后再用PBS洗涤两次，每次5min Hoechst染核, 室温放置5min 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照提纲观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例多能干细胞标记物的常用抗体：膜抗体：SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4胞浆抗体：Tra-1-60、 Tra-1-81核抗体：Oct4、Nanog、Rex1h

6、阳性对照阴性对照Rat-iPSCs观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例阳性对照阴性对照hhESCsTra-1-60观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例Pig-iPSCs观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例Human-iPSCs EB 分化染色Sox17AFPNestin-actinSMATuj1内胚层中胚层外胚层第二部分畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲畸胎瘤的获得ES细胞或iPS细胞的收集细胞数量：一个T75长到80-90%满时，细胞数大约为1000万个，可以打两个点，即每个点约300-500万个细胞；细胞处理：

7、小鼠及大鼠iPS细胞：将细胞消化成单细胞；1200rpm离心5min后弃上清；以小于400ul的10%DMEM重悬； 人iPS细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞团块沉底，并弃上清；以小于400ul的hES培基重悬；收集细胞到1ml注射器内并注射。畸胎瘤的获得ES细胞或iPS细胞的注射材料：多重免疫缺陷小鼠（ NODSCID小鼠）注射部位：后腿内侧肌肉注射畸胎瘤的生长和摘取畸胎瘤的获得通常注射30-40天之后，畸胎瘤就长成直径大概1-2cm左右的球体当畸胎瘤长到一定体积时，手术摘除畸胎瘤通常畸胎瘤都是实质性的，也有个别呈空泡状。约1-2cm畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切

8、片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备包埋切片材料4%PFA：固定畸胎瘤组织用石蜡（熔点约50-60度）：包埋组织石蜡包埋机（非必须）：包埋组织，还需要包埋盒、包埋底石蜡切片机（必须）：切半薄“Semi-thick”石蜡切片染色缸、染色架、载玻片、盖玻片溶液：载玻片：防脱片；也可以自制“蛋白胶”涂在切片上晾干乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform）HE染色液（H：Hematoxyline苏木精、E：Eosin 伊红）封片树脂染色架染色缸捞片、展片染色流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备在4%PFA中固定，4 （浸泡）过夜换成新鲜的 4

9、%PFA ，再次4浸泡过夜（过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）4固定是为了更好的保持标本的抗原性，室温也可以流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备包埋之脱水、透明70 EtOH 1h80 EtOH 1h90 EtOH 1h95 EtOH 1h100EtOH 1hFresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight氯仿 1h新鲜氯仿 1h新鲜氯仿 overnight 脱水透明流程畸胎瘤石蜡切片的制备包埋石蜡包埋盒经透明处理的样品溶解石蜡1h2h溶解石蜡50-60，取决于石蜡的融点固定包埋之包埋流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备包埋 之 包埋如果没有石蜡包埋机

10、，可以用60 烘箱代替；利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子；将样品快速放到石蜡包埋底内，盖上包埋盒的底座，直至石蜡全部凝结；修整蜡块形状、备用。溶解蜡存放槽出蜡口冷冻台高温镊子石蜡包埋盒和包埋底存放槽各种规格的石蜡包埋底用单面刀片修整蜡块，并达到以下要求：（1）蜡块呈正方形或长方形，蜡块各面要平直，样品位于蜡块正中央；（2）样品边缘与蜡块边缘的距离约3mm。 流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备包埋 之 修整蜡块样品与蜡块边缘有一定距离，以便切片能够连成蜡带平行流程固定畸胎瘤石蜡切片的制备包埋切片蜡块固定座刀片切片厚度微调旋钮手动切片转轮切片厚度：5微米蜡带毛笔固定包埋切片捞片、展片流程畸胎瘤石蜡切片的

11、制备37蒸馏水载玻片置于37-42 的烘片台（平面）上样品切片切片借助水的表面张力展开至平整吸除多余水分，37 烤片过夜,备用做好样品ID的标记流程畸胎瘤石蜡切片的制备烤片机37 烤片过夜，防止脱片展片温水槽温度设定：37-42左右固定包埋切片捞片、展片、烤片畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲流程 脱蜡亲水畸胎瘤石蜡切片的HE染色100% EtOH浸泡2次 10min/次95% EtOH 5min90% EtOH 5min80% EtOH 5min70% EtOH 5min蒸馏水浸洗3次， 5min/次Xylene1Xylene3Xyl

12、ene2Xylene4脱蜡亲水（非一次性使用，可反复多次使用）二甲苯浸泡4次 5min/次流程 染色畸胎瘤石蜡切片的HE染色在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，此步骤称为“盐酸分化”(1%盐酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含1%盐酸)将切片 在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称“蓝化”（颜色的适宜度取决于染色者的经验）蒸馏水中涮洗一下切片在Eosin溶液中染5min自来水涮洗至水接近无色蒸馏水涮洗一下切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min自来水中涮洗2、3次至水接近无色蒸馏水中涮洗1次流程 脱水封片畸胎瘤石蜡切片的HE染色100% EtOH浸泡

13、2次 10min/次脱水二甲苯浸泡4次 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4透明（非一次性使用，可反复多次使用）70% EtOH short time80% EtOH short time90% EtOH short time树脂封片，显微镜下观察(以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的Eosin颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。70和80的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用)流程畸胎瘤石蜡切片的制备在样品中央滴一滴封片树脂固定包埋切片捞片、展片封片封片树脂避免气泡