荧光光度法测定维生素B

1、实验、荧光光度法测定维生素B2一、实验目的1.掌握荧光光度分析的基本原理。2.掌握荧光光 度计的基本结构及操作技术。了解荧光光度计的应用。二、实验原理某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的 可见光，这种光称为荧光。各种物质经紫外光激发后能发出的荧光 特性与物质的化学性质有关。在激发光强度和所通过的溶液厚度不 变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度可用下式表示： b5E2RGbCAPIF =2.3 K KbcI0 当 I0 一定时，IF =Kc式中K取决于荧光效率，回是荧光分子的摩尔吸光系数，b是 液梢厚度，c是荧光物质的浓度。由此可见光在一定条件下，荧光 强度与物质的浓度

2、呈线性关系。用已知浓度的标准与待测样品同样 操作，通过测定荧光强度 F),按前述的标准曲线法和标准对照 法，求得待测物质的浓度。plEanqFDPw维生素B2,又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。维生素 B2 易溶于水而不溶于乙醍等有机溶剂。在中性或酸性溶液中稳定，光 照易分解，对热稳定。DXDiTa9E3d维生素B2水溶液在470nm或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧 光峰在520nm 在pH 57的溶液中荧光强度最大，在 pH 11的碱 性溶液中荧光消失。多维葡萄糖中含有维生素B1, B2, C, D2及葡萄糖均不干扰维生素 B2的测定。由于维生素B2在碱性溶液中经光 线照射，会发生光分解而

3、转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧 光强的多。因此，测量维生素 B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围 内，且须在避光条件下进行。RTCrpUDGiT 三、仪器和试剂.荧光分光光度计2. 40 wg/mL维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2,用 热蒸储水溶解后，转入 250mL棕色容量瓶中，冷却后加蒸储水至标 线，摇匀，置于暗处保存。5PCzVD7HxA 四、实验步骤.激发光谱的测定及最佳激发波长的选择固定检测发射）波长520nm用400 - 500 nm的光激发，找 出最佳激发波长.荧光光谱曲线的测定于50mL容量瓶中，加入40区g/mL维生素B2标准溶液 2.00mL,加水至标

4、线，摇匀。在荧光分光光度计上，用 1cm荧光比 色皿，激发波长470nm发射波长为480 - 580nm 范围内，测量溶 液的荧光强度，并绘制荧光光谱曲线。jLBHrnAILg 3.标准曲线的绘制于6只50mL容量瓶中，分别加入40g/mL维生素B2标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00mL,加水至标线，摇匀。在荧光分光光度计上，用 1cm荧光比色皿于激发波长 440nm发射波 长520nm处，测量标准系列溶液的荧光强度 ，并绘制标准（工作 曲 线。xHAQX74J0X4.未知维生素B2溶液的分析五、数据处理以相对荧光强度为纵坐标，荧光发射波长为横坐标绘制荧光光谱曲

5、线。以相对荧光强度为纵坐标，维生素 B2的质量为横坐标绘制各标 准曲线。未知溶液的分析。五、实验数据处理一）维生素 B2的激发光谱图 固定发射波长为 520nm用400-500nm的光激发）Wavelength (nm)由图知，维生素B2的最佳激发波长约为450nm以改波长作为之后荧光光谱的激发波长；二）荧光光谱曲线的绘制荧光光谱测定的实验条件如下:Instrument:RF-5301Spectrum Type: EMScan Range:480.0nm to 580.0nmEX Wavelength:450.0nmLDAYtRyKfESample Pitch:1.0Slit Width:EX

6、:3.0nmEM:5.0nmScan Speed:SuperSensitivity:HighResponse Time: Auto Shutter:Manual, Open以下荧光光谱曲线为浓度为1.6 pg/mL的维生素B2溶液的曲线三）标准曲线的绘制发光强度选定波长为520nm有1-5号溶液的浓度与荧光强度如下表12345浓度0.40.81.21.62.0/ug/mL荧光强度221.433429.134602.881834.8721016.057绘制出标准曲线如下:标准曲线12001000y = 498.75x + 22.38 = 0.9985浓度/ug/mL由曲线可求得，在实验条件下，维生素B2的荧光强度与浓度的关系的方程式为，I=498.75c+22.38四）未知维生素B2溶液的分析实验测得未知维生素B2溶液在上述实验条件下的，在 520n碗的荧光强度为446.839;