第12章毛细管电泳

1、第13章 毛细管电泳法capillary electrophoresis, CE第3节 毛细管电泳仪capillary electrophoresis apparatus第4节 毛细管电泳的分离模式separate types of CE第5节 应用与进展application and advances of HPCE第1节 概述generalization第2节 毛细管电泳理论basic theory of CE2022/7/25第13章 毛细管电泳法一、概述generalization二、经典电泳法traditional electrophoresis三、毛细管电泳法capillary e

2、lectrophoresis第1节概 述generalizationcapillary electrophoresis, CE2022/7/25 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 电泳：是指带电粒子（离子或胶粒）在电场的作用下，以一定的速度在缓冲溶液中的定向泳（移）动。 第1节 概述 generalization 按实验设备的形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电 泳、自由电泳； 电泳法或电泳分析：2022/7/25 高效毛细管电泳（high performance capillary electrop

3、horesis，HPCE），是一类以装有缓冲溶液的熔融弹性石英毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的分离效率极高分离分析方法。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75 m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术的迅速发展，成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。传统电泳法的局限性： 分离效率低、重现性差。 焦耳热（离子流的内热）较大，谱带增宽，柱效降低。2022/7/25 方法的原理与过程：在高压直流电场力的作用下，处于很细（内径2575m，长30100cm）毛细管内电解质溶液中的不同组分，由于所带电荷及性质的差异，迁移速率不同，经

4、过一定时间后，各组分将按速度的大小顺序，在不同时间依次到达检测器而被检测，从而得到按时间分布的电泳图谱，图谱上的迁移时间（ tm ）用作定性，峰面积用作定量。2022/7/25HPCE的优点： 电泳过程在毛细管内进行，易散热，降低了焦耳热 柱效高（ 105 107/m理论塔板数）、分离速度快 操作方便，分析成本低（水介质中进行）。 应用范围极广：有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等原因是：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。 一是 采用了很细内径的毛细管, 二是 施加了高达数千伏的电压。2022/7/25毛细管电泳与色谱的比较分离原理：同属于分离方法，但原理不同。分离过程：都是差

5、速迁移过程，可用相同的理论 来描述，如色谱中所用的一些名词概 念和基本理论，如保留值、塔板理论 和速率理论等均可借用于CE中。仪器流程：都包括进样部分、分离柱、检测器和 数据处理等部分。2022/7/25第13章毛细管电泳法一、电泳和电泳淌度electrophoresis and mobility二、电渗与电渗率electroosmosis and electroosmotic mobility三、表观淌度和权均淌度apparent mobility四、分离效率和分离度separation efficiencyand Resolution第2节毛细管电泳理论capillary electrop

6、horesis,CEbasic theory of HPCE2022/7/25第2节 基本原理当带电粒子以速度u在电场中移动时，所受的电场力为 FE = q E 式中FE 电场力；q溶质粒子所带的有效电荷； E电场强度。带电粒子运动时所受的阻力，即为摩擦力， F f = f uep 式中F f 摩擦力； f 摩擦系数； uep溶质粒子在电场中的迁移速度。当平衡时，电场力和摩擦力相等而方向相反，q E = f uep 一、电泳和电泳淌度 electrophoresis and mobility1.电泳和电泳速度2022/7/25则 uep = qE/f f 的大小和带电粒子的大小、形状以及介质粘

7、度有关。对于球形粒子， ；对于棒状粒子， 其中 是离子半径； 是液体介质的粘度。所以或 当E与 一定时，q/r 越大，即体积越小，电荷越高的粒子uep越高，迁移越快；q/r 越小，即体积越大，电荷越低的粒子uep越低，迁移越慢； 不同物质在同一电场中，由于它们的有效电荷、形状及其大小的差异，因它们电泳迁移速度的不同，而实现相互分离。球形粒子棒状粒子中性粒子电泳速度为零！2022/7/252.电泳淌度 ：单位电场强度下的平均电泳速度。 棒状粒子球形粒子不同组分有不同的电泳淌度。2022/7/253.有效淌度 在实际溶液中，离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，考虑了这些影响因素后

8、的淌度称为有效淌度。式中 为样品分子的第i级离解度， 为活度系数。 总之，带电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质特性有关外，还与粒子的解离度、电荷数及其大小和形状有关。2022/7/25二、电渗和电渗流 electroosmosis and electroosmotic mobility1.电渗 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷（如石英毛细管柱内壁，当内充液pH3时，表面电离成Si-O-,带负电荷），因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。2022/7/252. 电渗流（ electroosmotic flow，EOF ）电渗现

9、象中整体移动着的流体叫电渗流。其速度为uos。 当在毛细管两端施加电压时，带正电荷的阳离子向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起管中的溶液整体向负极移动(管内液体犹如带电外壳所包围)，这种液体相对于固体表面的移动叫电渗。 （由于外加电场对管壁溶液双电层的作用，所引起的管内液体的整体流动）2022/7/253. 电渗流的速度与方向 电渗流的速度用 表示，取决于电渗淌度 和电场强度E ，即 在通常的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，其大小受电场强度、溶液的极性、Zeta电势、和介质粘度的影响。 是粒子的Zeta电势，近似地正比于 ，即粒子的表面电荷越大，摩尔质量越小， Ze

10、ta电势越大。 当其他条件一定时，不同的带电离子可按其表面电荷密度的差异，而有不同的电渗淌度实现相互分离。 2022/7/252022/7/25在一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的5-7倍。 实际电泳分析中，可按下式计算 uos = Lef/tos Lef 毛细管有效长度（毛细管的进样端至检测窗的长度）； tos电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。2022/7/25电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改

11、性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。2022/7/254. 电渗流的流形 高效液相色谱中的溶液流动为层流（压力流），抛物线流型，引起谱带展宽较大。不同驱动力的流型和相应的谱带峰形电渗流的优点之一是具有平面流型！谱带展宽很小！2022/7/255. 电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍； 各种电性离子在毛细管柱中的实际（表观）迁移速度为： 阳离子: 电泳方向与电渗流方向一致,实际迁移速度最大,最先流出柱. 中性粒子:uef = 0， uap = uos ,随电渗流同行,

12、 中间流出柱. 阴离子:电泳方向与电渗流相反,最后流出柱或无法流出柱. 阳离子阴离子中性分子 uef uos， uap电泳时,阴离子在负极最后流出。相反时，无法流出 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。2022/7/25操作条件的选择工作电压 柱效随工作电压的增大而增高，但工作电压增加，工作电流也增大，焦耳热的影响加剧，柱效反而下降。 一般通过作IV曲线来选择体系的最佳外加电压值。2. 缓冲液的选择2022/7/25（1） 缓冲液的种类 所选择的pH值范围内有很好的缓冲容量。 检测波长的吸收低。 自身的淌度低，即分子大而电荷小，以减少电流的产生。 为了达到有效的进样和合适的电泳淌度，

13、缓冲液的pH值至少必须比分析物质的等电点高或低1个pH单位。 只要条件允许就尽可能采用酸性缓冲液，在低pH值下，吸附和电渗流值都很小，毛细管涂层的寿命较长。一般多采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液。2022/7/25（2）缓冲液的pH值pH值增大，表观淌度增大，分离时间缩短，柱效提高。 缓冲溶液的离子强度增大，电渗流减小，迁移时间延长。 对于迁移时间较短的组分，其柱效随浓度的增加而明显增大。 （3）缓冲溶液的离子强度或浓度（4）缓冲溶液添加剂 在缓冲溶液中适当添加其它试剂，如表面活性剂、有机溶剂、中性盐类、两性物质和手性选择剂等，可以改善柱效，改变选择性，进而改善分离度。2022/7/25图13-7金银

14、花样品的毛细管电泳指纹图谱（s）.绿原酸2022/7/252022/7/25药物分析analysis of pharmaceutics2022/7/25应用实例1.CZE测定葛根及其制剂正心泰胶囊中葛根素的含量 缓冲液为3OmmolL硼砂缓冲溶液(pH9.37)，电压30 kV，检测波长254nm，双氯灭痛为内标物。葛根素的线性范围10100gml，回收率为97.53%，RSD为0.9%(n=5)。2. CZE测定枸橼酸苷多芬的含量 采用40cm75m毛细管柱，以粉防己碱为内标，25mmolL硼砂(pH7.89)为缓冲液，电压14kV，紫外检测器，检测波长214nm，在4min内可完成枸橼酸苷

15、多芬与内标物的分离和测定，最低检测浓度为5gml，在2448gml范围内线性关系良好(r一0.999 8)，日内RSD1.58，日间RSD2.46%，回收率为95%105%。2022/7/253.CZE测定三烯酸腺苷二钠制剂含量及有关物质 采用熔融石英毛细管柱，以0.025molL磷酸氢二钠(pH 10.2)为缓冲液，检测波长为214nm，电压21kV的条件下进行定量分析。三烯酸腺苷二钠的线性范围为0.32.0 mgml，(r=0.993 9)，回收率99.1% ，RSD2.0 ，最小检出浓度0.5gml。4.CZE拆分布洛芬对应体异构体 以20mmolL硫酸盐为运行缓冲液(pH 7.1)，5

16、0mmolL-CD和3OmmolL去氧胆酸钠(SDC)为手性选择试剂，石英毛细管柱47 cm75m，二级管阵列检测器，214nm处检测，运行电压12kV，温度23 ，布洛芬的加样回收率分别为97.8%和101.4% ，RSD分别为0.14%和0.26%。2022/7/25二、 胶束电动毛细管色谱（MEKC）micellar electrokinetic chromatography，MEKC 由于CZE无法分离不同结构的中性分子，为了分离不同结构的中性分子，发展了MEKC。 该法集电泳、电渗与分配于一体，是一种电泳技术与色谱技术相结合的分离方法，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 MEKC是Te

17、rabe等在1984年提出的。将高于临界胶束浓度的离子型表面活性剂加入缓冲液中形成胶束，被分析物在胶束(假固定相，准固定相)和水相中进行分配，中性化合物根据其分配系数的差异进行分离，带电组分的分离机理则是电泳和色谱的结合。2022/7/25 胶束准固定相：在含有缓冲溶液的毛细管中加入离子型表面活性剂，当浓度增加到一定程度时，表面活性剂分子在溶液中形成疏水基向内，亲水基向外的多分子聚集体，称作胶束。形成胶束的最低浓度被称作临界胶束浓度（critical micellar concentration,CMC）。低于该浓度时，主要是以单个分子或离子状态存在。如十二烷基硫酸钠所形成的带负电荷的球体胶束

18、。 在MEKC系统中，存在类似于色谱的两相：一是流动的水相，另一是起到固定相作用 的胶束相。由于该相（“固定相”）是可移动的，这种移动的“固定相”被称之为准固定相或假固定相。2022/7/251分离原理在MEKC中，中性溶质按其疏水性不同，在缓冲溶液（水相）和胶束（准固定相）之间分配。疏水性强的溶质分配到胶束中的多，Kp大；反之，亲水性强的溶质分配到胶束中的少， Kp小。 当溶质进入胶束时，以胶束的速度向阴极迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度向阴极迁移。在胶束中分配系数越大的溶质，在柱中迁移时间越长。从而使疏水性稍有差别的不同中性物质在电泳中得以分离 。 总之：中性化合物根据其分配系数的差

19、异进行分离，带电组分的分离机理则是电泳和色谱的结合。疏水性强的溶质后流出，疏水性弱的溶质先流出2022/7/25 2.应用 MEKC在天然药物和中成药的有效成分分析中最具特色，它可以排除高含量组分的基本干扰，能分离CZE无法分离的电中性化合物，适用于天然药物中各种复杂组分的测定。中药的有效成分种类繁多， MEKC目前主要用于生物碱、黄酮类、葸醌类、苷类化合物等各种成分的分离。2022/7/25三、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜

20、、易制备。 CGE是在毛细管内壁将聚丙烯酰胺等交联生成聚合物凝胶，当带电的被分析物在电场的作用下进入毛细管后，聚合物起着类似“分子筛”的作用，试样中各组分按分子尺寸大小进行分离。小的分子容易进入凝胶而后流出毛细管，大分子则受到较大的阻碍而先流出毛细管。2022/7/25四、毛细管电色谱capillary electrochromatography ，CEC五、非水毛细管电泳（NACE）non-aqueous capillary electrophoresis在有机溶剂为主要的非水体系中进行的毛细管电泳。CEC是在毛细管中填充或在管壁涂布、键合类似HPLC的固定相，在毛细管的两端施加高电压，以电

21、渗流代替高压泵推动流动相。试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。CEC将HPLC的高选择性和CE的高柱效有机地结合在一起。2022/7/25思考题1.简述毛细管电泳的分离机制和特点以及与色谱的区别。2.请用色谱基本理论来解释CE能实现高效和高速分离的 原因。3.在CE中影响谱带展宽的因素有哪些？4. MECC和CZE的区别是什么？5.设某CE系统的电压为25kV，柱长Ld为55cm，某离子的扩 散系数为2.010-9 m/s，该离子通过柱的时间是10min。 求该毛细管柱的理论塔板数。6.设某CZE系统的毛细管长度L=65cm，由进样口至检测器 长度Ld=58cm，分离电压V=20k

22、V，扩散系数D= 5.010-5 cm/s。测得某中性分子A的迁移时间是9.96min。求出 该系统的电渗淌度；求电泳淌度为2.010-5 cm/(Vs)的 阴离子B的迁移时间；以A计算的理论塔板数；求A和 B的分离度。2022/7/25第十一章高效毛细管电泳分析法一、离子分析analysis of ion二、药物分析analysis of pharmaceutics三、手性化合物分析analysis of chiral compounds四、氨基酸分析analysis of amino acids五、核酸分析及DNA测序analysis of nucleic acids and sequen

23、ce of DNA六、新进展及热点问题advances and special topics第五节高效毛细管电泳应用与进展high performance capillary electrophoresis,HPCEapplication and advances of HPCE2022/7/25一、离子分析 analysis of ion阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了24种金属离子； 阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；2022/7/25阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测； 加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；2022/7/25二、药物分析 analysis of pharmaceutics 检测体液或细胞中某些代