柚皮中多糖的提取及测定

1、柚皮中多糖的提取及测定: Polysaccharide is an important biologically active substance with the physiological functions of immune enhancers, cell growth and aging regulation. Polysaccharides can be widely used in medicine, health products and functional foods, as green bio-medical products, it has a broad market

2、 prospect. Pomelo peel contains a variety of substances; it has high food value in addition to medicine value. In this paper, extraction technique of polysaccharides is researched, with polysaccharide molecular structure and physicochemical properties as the basis; we adoptes the method of water ext

3、raction and alcohol precipitation of the polysaccharide to extract polysaccharose in pomelo peel.实验材料、试剂、仪器实验材料、试剂。柚子皮、无水乙醇、 95%乙醇、乙醚、 10%氯化钙、苯酚、 95%硫酸、正丁醇、丙酮、甲醇、氨水、葡萄 糖、三氯醋酸三氯甲烷。1.2实验仪器。FY130型药物粉碎机，天津市泰斯特仪器 XX 公司。 H.HS.21.8 型电热恒温水浴锅 , 江苏常熟医疗器械厂。 SHZ-D 型真空泵，巩义市英予华仪器厂。RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚 荣生化仪器厂。JA2003型

4、分析天平，上海衡平仪器仪表厂。1610 型离心机，北京康瑞名科技XX公司。CS1012型电热鼓风干燥箱， 重庆实验设备厂。721E型可见分光光度计，上海光谱仪器XX公 司。实验方法多糖的提取。多糖浓缩液的制备。精确称取干燥为恒重的柚皮粉末 60 克 , 平均分成三份 , 每份 20 克。分别置圆底磨口烧瓶中 , 每只烧瓶中加入无水乙醇 80mL、 乙醚80mL甲醇80mL丙酮80mL。用玻璃棒搅拌，在室温下放 置过夜。用真空抽滤法过滤 , 将残渣挥干溶剂。得残渣 50 克。将 所得残渣平均分成三分 , 每份 17.777 克。分别置圆底磨口烧瓶中 加10倍体积的蒸馏水。80C水浴3小时。水浴过

5、程中经常用玻 璃棒搅拌。用双层纱布过滤,50克柚皮共收集滤液400mL。残渣 继续加10倍体积蒸馏水80C水浴3小时。用双层纱布过滤,50 克柚皮共收集滤液450mL。合并两次滤液。放置过夜。将滤液在 15C、7500r/min转速、时间10分钟的条件下离心，弃去底层沉 淀,取清液。将离心所得的上清液共850mL用真空旋转蒸发仪浓缩5倍,得浓缩液170mL缩液到入锥行瓶中待用。贴标签注明 浓缩液。多糖提取工艺。同上，另制备多糖浓缩液80mL,取 4只锥型瓶，各注入20mL 浓缩液，分别加入95%勺乙醇40mL 60mL 80mL 100mL沉淀多 糖, 并以标签标明加入乙醇倍数。放置过夜。分别

6、将不同乙醇浓 度的溶液在15C、7500r/min转速、时间10分钟的条件下离心， 弃去上清液。底层沉淀加丙酮洗涤 , 同样条件下离心。取底层沉 淀。将产品置烘干箱中在 70C的条件下干燥2小时,称重。结果 表明,在四倍乙醇的条件下多糖沉淀效果最好。分别向剩余浓缩液中加入四倍体积95%乙醇, 沉淀多糖。室温下放置过夜。将溶液在 15C、7500r/min转速、时间10分钟 的条件下离心 , 弃去上清液。 底层沉淀加丙酮洗涤 , 同样条件下离 心。取底层沉淀。将从浓缩液中沉淀出的多糖盛在平皿中 , 用标 签注明多糖粗品，再置70C烘干箱中干燥2小时。称重，得多糖 粗品 4.6 克。纯化实验。去果

7、胶实验。果胶是亲水胶体其水溶液在适当条件下可形成凝胶 , 一般在 条件为:果胶浓度0.3%0.7%以上,pH7.58.5的条件下加入二 价钙离子或二价镁离子做交联剂 , 使果胶与其形成果胶钙或等凝 胶, 再经离心 , 把果胶分离出来 1 。去蛋白质实验。三氯醋酸法去蛋白 : 此方法沉淀蛋白质属于生物碱试剂沉淀 法向蛋白质溶液中加入属于生物碱试剂的三氯醋酸 , 当溶液的 pH 底于等电点时 , 蛋白质分子是以阳离子的形式存在易与三氯醋酸作用生成不溶性盐沉淀 , 并伴随发生蛋白质分子变性 , 进而将蛋 白质分离出来 5 。sevage 法去蛋白 : 是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的 特点将蛋白

8、质溶液加入氯仿和正丁醇的混合液中 , 剧烈摇动。使 蛋白质与氯仿 - 正丁醇形成凝胶物而分离 , 离心后分去水层和溶 剂层交界处的蛋白质 , 即可达到去除蛋白质的目的 2 。多糖的测定3.1 标准葡萄糖溶液的配制。精密称取干燥恒重的葡萄糖1.2500克。将其定容至 250mL容量瓶中，吸取5mL至另一 250mL 的容量瓶中 , 再稀释到刻度 , 得浓度为 100mL/L 的标准溶液 3 。10%苯酚试剂的配制。精密称取 25.0克苯酚置250mL容 量瓶中 , 用水稀释到刻度 , 摇匀 , 避光, 冷藏3 。样品液的配制。精密称取纯化后的多糖 0.025 克, 无损 失的到入250mL容量瓶

9、中，加蒸馏水稀释到刻度。最大吸收波长的测定。精密量取标准葡萄糖溶液 1mL, 加入1mL10%Q苯酚溶液，再加入5mL95的浓硫酸，室温下放置 10min, 振动 5min 后再放置 10min。用可见光分光光度计分别测定其在510nm、 505nm、 500nm、495nm 490nm 485nm 480nm 475nm这八种不同波长下的吸光 度。结果表明490nm是最大吸收波长。标准曲线的绘制。精密量取标准葡萄糖溶液 0.0 、 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于试管中，分别加蒸馏水至1.0mL。加 入 10%的苯酚溶液 1.0mL, 摇匀。将试管放于冷水中 , 缓慢加入 9

10、5% 浓硫酸 5.0mL, 各管加完后同时拿出 , 在室温下放置 10min 后摇匀 , 再放置20min。在490nm下比色测定，以糖的质量浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。不同浓度的标准溶液在 490nm下的吸光度制得标准曲线如图 :根据所得数据 , 设直线回归方程为y=a+bx则得该直线回归方程为y=0.0406+0.204x相关系数 r=0.9993.6样品测定。精密量取样品液1mL置于试管中，加入10%的苯酚溶液 1.0mL, 摇匀。将试管放于冷水中 , 缓慢加入 95%浓硫 酸 5.0mL, 各管加完后同时拿出 , 在室温下放置 10min 后摇匀, 再 放置20min。在490nm下以空白试剂做参比,按绘制标准曲线同 样的方法比色测定 4 。最终测定样品液的吸光度为 0.218A根据所建立的回归方程 , 按公式 :多糖含量 =(A00406) X 0.25/0.204 X 1000X 0.025 X 100%其中A为样品液的吸光度计算得提取得到的产品中多糖含量为 87.0%结论本次实验通过水提醇沉法提取柚皮中的多糖 , 采用去果胶 , 三氯醋酸法去蛋白质、 sevage 法去蛋白质的方法对提取出的粗 多糖进行纯化。 并用苯酚 - 硫酸法对所得产品进行含量测定 , 得出 较符合实际的结果。但是,在实验过程中同样发现了一些问题