抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体重链可变区基因的克隆及序列分析

1、抗缓慢爱德华菌奇特型单克隆抗体重链可变区基因的克隆及序列阐发秦红,黄威权，杨向民,温伟红,杨安钢、【关键词】缓慢爱德华菌;,抗奇特型抗体;,基因克隆;,序列阐发摘要目的:克隆并阐发缓慢爱德华菌抗奇特型单克隆抗体AbVH基因。要领:从排泄缓慢爱德华菌抗奇特型Ab的杂交瘤细胞株1E11中提取总RNA,利用RTPR技能,扩增缓慢爱德华菌抗奇特型抗体VH基因,并将其克隆到PBSTvetr中举行序列阐发。效果:VH基因的全长序列为339bp,编码113个氨基酸。通过NBI/BLAST/N和IGT数据库Lefrane,2001阐发表白,VH基因切合小鼠IgGV区基因的特性:含有4个框架区FR,3个抗原互补

2、决定区DR及两个抗体特性性的半胱氨酸。结论:乐成地克隆了缓慢爱德华菌抗奇特型AbVH基因,为进一步构建缓慢爱德华菌抗奇特型抗体基因工程疫苗奠基了基矗关键词缓慢爱德华菌;抗奇特型抗体;基因克隆;序列阐发缓慢爱德华菌(Edardsiellatarda)是淡、海水养殖鱼类的一种最重要的病原菌1,具有很强的致病性,其熏染具有盛行面积广、发病率及殒命率高等特点,是水产养殖业中危害最大的一种疾玻该菌的宿主范畴较普及,常能从多种冷血动物、鸟类、温血脊椎动物及情况中分散出2,可引起人类的种种熏染胃肠炎、败血症、肝脓肿、脑膜炎、伤口熏染等。临床表示为腹泻、水样便、伴吐逆、腹痛及低热等。别的,亦有报道缓慢爱德华菌

3、可引起肝脓肿、脑膜炎及软构造熏染等的报道3。如今,海内对该菌的治疗仍旧是应用种种抗生素等药物,如在饵料中添加适量的土霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺类药物等,并按期用福尔马林药裕但恒久应用抗生素易产生耐药性和药物残留等负面影响4,5。欧、美等国度已有将弧菌、气单胞菌及爱德华菌等制成灭活疫苗,并从中提取多糖、胞外卵白等有用抗原,制备了单克隆抗体Ab工程疫苗,且已商品化消费。由于灭活疫苗的抗原性较弱,而减毒疫苗的宁静性不不变,为此,研制利用便利、高效、易商品化大范围消费、实在有用的疫苗,对水财产甚为需要。我们初次从排泄抗缓慢爱德华菌奇特型Ab的杂交瘤细胞株1E11中提取总RNA,并以

4、RTPR乐成克隆了该Ab的VH基因。1质料和要领1.1质料排泄抗缓慢爱德华菌奇特型Ab的杂交瘤细胞株1E11为本室创立6。RPI1640干粉为GibBRL公司产物。RNA抽提试剂TRIzlTReagents购自TaKaRa公司。RTPR试剂盒为美国Invitrgen公司产物。质粒提取试剂盒和胶接纳试剂盒,均购自北京博大泰克公司。PR试剂,毗连试剂和pBSTvetr均购自北京天为期间公司。1.2要领缓慢爱德华菌抗奇特型AbVH基因的扩增:清醒排泄抗缓慢爱德华菌奇特型Ab的杂交瘤细胞株1E11,传至3代使细胞数量达2.8107/L后劳绩细胞。用TRIzlTReagents、氯仿和异丙醇抽提RNA后

5、,以无水乙醇沉淀。以11LRNA为模板,以ligdT20为随机引物,反转录合成DNA第1链。PR引物序列:Bak:5ATGAAATGAGTGGGGAT(,G)TTTT3;Fr:5AGTGGATAGAAGATGGGGG3。在25L反响体系中,参加DNA2L,Bak和Fr引物各1L举行PR。反响参数为:于94变性5in后,94、1in,50、1in,72、1in,共25次循环后,于72再延伸10in。PR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳断定。2效果2.1RTPR扩增产物的断定经10g/L琼脂糖凝胶电泳断定表白,VH基因的RTPR产物巨细为420500bp图1。图1Ab1E11VH基因RTPR产物的琼

6、脂糖凝胶电泳阐发略1:DL2000DNAarker;2:VH基因的RTPR产物.2.2VH基因的克隆及序列阐发将PR扩增的VH基因胶接纳后,克隆入pBSTvetr载体中,并转化E.liDH5的感觉态细胞中,经Xgal蓝白挑选后,挑取阳性克隆,经菌落PR断定准确后举行测序。测序效果经IGT数据库Lefrane,2001阐发表现,VH基因具有小鼠IgGVH基因的特性,含有3个DR区,4个FR区和两个抗体特性性的半胱氨酸(图2)。图2抗缓慢爱德华菌奇特型AbVH基因的核苷酸及推导的氨基酸序列略3讨论克隆得到准确的抗体轻、重链可变区基因,是制备基因工程抗体中最紧张也是最关键的一步。由于在RTPR而得到

7、的杂交瘤细胞株的DNA中,一些非复制的重排片断是最正确的PR模板;并且在举行细胞融适时大概交融不止一个脾细胞至骨髓瘤细胞,从而导致多种成效性以及非成效性V区基因产生。因此在做PR克隆抗体轻、重链可变区基因时,大概会克隆出除目的基因以外无关的轻重链基因。别的,由于V区基因内部的5端和3端的突变大概会按捺引物退火而拦阻扩增反响。因此我们接纳了抗体重链可变区基因5端的信号肽,及3端恒定区的通用引物,通过NBI/BLAST/N和IGT数据库Lefrane,2001将PR出的基因序列举行阐发,寻出抗体重链可变区的基因序列,并在盘算机上举行Blast综合阐发,颠末以上研究事情的重复论证,以确保抗体重链可变

8、区基因的完备和正确。效果,通过Blast阐发未见雷同序列。我们得到的抗体重链可变区VH基因共编码113个氨基酸,序列中无停顿暗码子,为一开放读框;具有4个FR,3个DR和维持抗体V区空间布局所必须的2个特性性的半胱氨酸,别离位于第22位和第96位,为VDJ重排,切合小鼠IgGVH基因特性。同源性阐发表白,我们所得到的VH基因与GenBank中序列号为13832.1(Identities96%)和U88672.1(Identities93%)序列相似性较高,它们均为小鼠重链可变区基因。缓慢爱德华菌抗奇特型Ab重链可变区VH基因的乐成得到,为制备新型、有用的缓慢爱德华菌抗奇特型基因工程抗体奠基了基

9、矗参考文献:1AandiA,HiuSF,RhveJS,etal.IslatinandharaterizatinfEdardsiellatardafrfallhinksaln(nrhynhustshaytsha)J.ApplEnvirnrbil,1982,43:1380-1384.2hiteFH,SipsnF,illiasLEJr.IslatinfEdardsiellatardafraquatianialspeiesandsurfaeatersinFlridaJ.JildlDis,1973,9:204-208.3HltJG,KriegNR,SneathPHA,etal.Bergeysanualfdeterinativebaterilgy.(NinthEditin),Baltire,illiasandilkins,1994:190-194,253-274.4张晓君,战文斌,陈翠珍,等.牙鲆痴钝爱德华菌熏染症及其病原的研究J.水生生物学报,2022,291:31-37.5AkiT,EguasS,atanbeT.De