实验二-PCR检测乙肝病毒PCR-SSCP检测-人HLA-DRB基因多态性

1、实验二PCR检测乙肝病毒&PCR-SSCP检测人HLA-DRB基因多态性乙肝病毒PCR实验操作HLA基因PCR实验操作血清样本处理（模板的制备）PCR检测乙肝病毒实验PCR反应上机口腔细胞DNA电泳（模板的检测）HLA基因PCR实验操作PCR反应上机 琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、凝固后拔梳） 倒缓冲液 （样品中加入1/5体积的上样buffer）加样，电泳（方向、电压、时间） 染色与检测 （EB浸泡10 min，紫外下检测）电泳实验的步骤及注意事项电泳基本原理及相关知识 DNA琼脂糖凝胶电泳 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电

2、极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳的基本原理利用物质的差异特性来分离物质电荷差异 电荷性质 电荷数量分子差异 分子大小 分子形状 电泳的影响因素 带电粒子的性质 电场强度 溶液的pH 溶液的离子强度 电渗现象 环境因素 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的DNA显色

3、剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光DNA琼脂糖基本原理/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html实验结果的分析PCR基本原理及相关知识 The Polymerase Chain Reaction Sometimes called molecular photocopying, the polymerase chain reaction (PCR) is a fast and inexpensive technique used to amplify, or make many co

4、pies of, small segments of DNA. the technology empowers scientists to undergo a number of processes, from DNA fingerprinting to mapping the human genome. In 1983, Kary Mullis invented the PCR. The process is an invaluable tool to todays molecular biologists and biotechnology corporations.Kary B. Mul

5、lis As he wrote later in Scientific American:Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents and a source of heat. (1944 - )T

6、he Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method（1/2 of the prize ）3 step and 30 cycles for PCRStep 1. DenaturationStep 2. AnnealStep 3. Extend30 cyclescreate over a billion copies of the sequenceStep 1. DenaturationThe reaction is first heated to dena

7、ture (separate) the sides of the double- stranded DNA Temperature: 95 degrees Celsius Step 2. Annealthen cooled to allow the primers to find and bind to their complementary sequences on the separated strands.Temperature: 55 degrees Celsius Step 3. Extendthe polymerase to extend the primers into new

8、complementary strands.Temperature: 75 degrees Celsius Repeat the CyclesRepeated heating and cooling cycles multiply the target DNA exponentially, since each new double strand separates to become two templates for further synthesis. This process can then be repeated up to 30 times to create over a bi

9、llion copies of the sequence. What is in the PCR Mix?Template (dsDNA)Primers (TWO short DNA: 15-30 nucleotides in length. Longer primers provide higher specificity ) P22Taq polymerase （ Thermus aquaticus ）dNTP Mix (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)Reaction Buffer (including Mg2+)10PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括：

10、250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白 影响PCR的主要因素 PCR反应体系的各个组分 PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 操作环境 一般PCR实验设计：样品反应不同的退火温度梯度不同的Mg 2浓度不同的模板浓度阴性对照反应阳性对照反应 相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强； 广泛的应用于医学诊断

11、、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。二、 PCR试剂盒检测HBV DNA 实验操作及注意事项 HBV检测试剂盒介绍构成：DNA提取液检测反应管（PCR反应体系，上样buffer，石蜡油）阳性模板设计：反应管中有针对HBV的特异性引物，若出现与阳性对照相同的结果，则说明待测样品中含有HBVPCR实验具体操作 1、待测样本的制备：提取血清中DNA待测血清40l + 40l DNA 提取液，混匀 沸水浴10min，10000rpm5min上清样品模板TE 40l + 40l DNA 提取液，混匀沸水浴10min，10000rpm5min上清空白模板待测样品的制备空白对照的制备实验分组（每2人做一管PCR反应）分10个平行的实验小组，每组包括：阳性反应1个空白对照1个样品检测反应n个阳性模板2l空白模板2l样品模板2l混匀， 6000rpm5s，上PCR仪933min 预变性94，30s55，30s72，30s72保温5min30个循环PCR反应程序：三、PCR-SSCP检测人HLA-DRB 基因多态性PCR实验操作及注意事项 实验目的及预期结果目的：检测来自不同样本的基因多样性检测技术：HLA-DR基因的PCR-SSCP预期结果：PAGE电泳条带的差异基本过程来源不同的待测样本PCR扩增目的基因变性成单链PAGE电泳结果比较（银染）实验主要步骤HLA基