肺炎链球菌检测与分型技术

1、肺炎链球菌检测与分型技术肺炎链球菌简介(Streptococcus pneumoniae; Pneumococcus)一般称为肺炎双球菌或球菌Gram+ 双球菌或链球菌，溶血（草绿色溶血环）荚膜包覆的肺炎链球菌具有致病力 荚膜多糖体该菌株致病的主要因子可以保护菌株免于被巨噬细胞等吞食具有抗原性各具免疫反应特异性目前可知超过90种 Streptococcus pneumoniaeCapsule major virulence factor91 different capsule types (serotypes).110F18B28A40PCV7: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F

2、, 23F211A18C28F41PHiD10: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F311B18F2941FPCV13: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 6A, 19A411C19A3142 PPV23: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 19A, 2, 8, 511D19B32A43 12F, 15B, 17F, 20, 22F, 33F, 9N, 10A, llA6A11F19C32F446B12A19F33A456C12B2033B467A1

3、2F2133C47A7B1322A33D47F7C1422F33F487F15A23A34 6D?815B23B35A 11E?9A15C23F35B9L15F24A35C9N16A24B35F9V16F24F3610A17A25A3710B17F25F3810C18A2739肺炎链球菌的发现1881年美国George Sternberg与法国Louis Pasteur首次各別从唾液中发现微尖型的双球菌Pasteur将患有狂犬病病死儿童的唾液植入兔子，而Sternberg将自己唾液植入兔子，二者结果皆可在兔子血液中分离出双球菌。1886年Fraenkel认为应将该菌归类为肺炎球菌同年Weisc

4、helbaum建议命名为Diplococcus pneumoniae但是直到1920年才正式被承认而目前的命名Streptococcus pneumoniae是在1974被确定，主要是经过rRNA基因序列分析而得名。著名的转化试验 1928年 Griffith鼻窦鼻肺鼓膜血管脑膜骨骼肺肺炎链球菌定植与扩散鼻咽部：移殖部位气管吸入肺炎球菌疾病患者无症状携带者气溶胶 鼻腔至少有60%的健康学龄前儿童、30%的健康学龄儿童与成人在鼻咽部携带有肺炎球菌扩散沒有感染者帶菌者发病者突破血脑屏障肺炎球菌菌血症鼻窦炎脑脊液渗漏脑膜炎中耳炎鼻咽部移殖肺炎突破吞噬细胞防御系统突破呼吸道粘膜纤毛防御系统腹膜炎关节炎

5、等Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: ASM Press; 1994. p. 322-31肺炎链球菌疾病负担侵袭性肺炎球菌疾病及其相关死亡CDC急性细菌性疾病监测* （2006年）458例死亡。死亡率 65岁 1岁: 0.71 / 100 000*覆盖2800万(占美国人口9%)13欧洲1985 2006年2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾病发病（发表的研究）*每10万 2 岁儿童的年发病数Adapted from McIntosh 2007. E

6、pidemiology and Infection (2007), 135:644-656 侵袭性肺炎球菌疾病脑膜炎肺炎球菌疾病死亡率最高的10个国家多数位于亚洲和非洲占全球死亡的%Source: WHO全人群15全球所有年龄疫苗可预防疾病死亡数疫苗可预防疾病死亡数(WHO, 2003年6月)肺炎球菌疾病轮状病毒流脑ACHib黄热病乙型肝炎百日咳破伤风脊灰麻疹白喉5岁以内 5岁以上 合计16肺炎球菌会导致 31-33%的急性中耳炎40%治疗失败 长期或复发中耳炎:50%的病例分离的细菌里，80%对青霉素耐药Gehanno P et al. PIDJ 2001; 20:570-3. Maille

7、t F. 1998 2000 BEH n42/2002:207-8. Gehanno P et al. PIDJ 1998; 17:885-90Husson MO et al. Pathol Biol 2001. 49: 789-93.急性中耳炎: 容易被忽略的感染17肺炎链球菌研究的关注重点病原学研究（检测与鉴别）分子特征研究（分子分型与进化）耐药性研究肺炎链球菌的检测与鉴别肺炎链球菌的分型方法肺炎链球菌的检测培养基：哥伦比亚血琼脂/巧克力琼脂溶血环510CO2、35培养1820h菌落形态扁平（脐窝）/粘液镜下观察革兰氏染色/电镜生化鉴定-胆汁溶解（+）生化鉴定-奥普托欣实验（敏感）试剂盒-

8、生物梅里埃API（生化鉴定仪）API 20 STREP 链球菌及有关种类的鉴定系统（Ref. 20600）API 20 STREP 肺炎链球菌药敏卡片（ Ref.22231 ）适用范围：细菌培养物优点：可鉴别多种相关细菌试剂盒-生物梅里埃Slidex Pneumo Kit适用范围：脑脊液、细菌的培养物优点：灵敏、易判读、准确度较高试剂盒-OXOID DRYSPOT PNEUMO TEST适用范围：脑脊液 细菌培养物优点：灵敏、易判读、准确度高试剂盒-BinaxNow Streptococcus Pneumoniae适用范围：尿液 脑脊液 细菌培养物优点：操作简便、准确度高其他检测方法：普通PC

9、R检测（cpsA）荧光PCR检测（lytA）常用于肺炎链球菌的分型方法1.基于血清学特征的：血清分型/群、普通PCR分型、荧光PCR分型2.基于分子特征的：MLST、MLVA、PFGE基于血清学特征血清分型/群以荚膜多糖的特异性为基础荚膜肿胀试验（Quellung Reaction ）是肺炎链球菌区分血清型的金标准PneumococcusPolysaccharide Capsule血清分型的意义（1）各血清型的发病率不同 :Hausdorff WP, et al. CID 2000; 30: 122-40. Valles X, Flanner B, et al. Trop Med Int He

10、alth 2006; 11(3): 358-66 年龄 地区分离物阳性的比例幼儿血清培养结果血清型分离物阳性的比例亚洲研究的血清培养结果血清型血清分型的意义（2） 感染后的致病部位 血清型常见的致病部位1, 14血液6, 10, 23脑脊液3, 19, 23中耳免疫状态对抗生素的耐药不同一些种族或民族之间不同血清型携带与侵袭能力侵袭携带分离物数量Source: Clinical updates in Pediatric Infectious Diseases. Vol2(6): Feb 1999.丹麦SSI日本生研基于血清学特征SSI Pneumococcus antiseraSSI胶乳优点：

11、操作简单、结果易判读局限性：价格昂贵鉴定范围有限基于血清学特征PCR分型血清分型：成本高、操作复杂、处理量小，依赖于培养PCR分型方法：成本低、操作简单、高通量可以对临床标本进行检测基于血清学特征PCR分型 引物设计来源41对引物基于血清学特征PCR分型基于血清学特征PCR分型存在缺陷：1.对仪器设备有一定的依赖性2.不能对全部血清型/群进行鉴别3.存在一定比例的分型错误基于血清学特征荧光PCR分型:灵明度更高特异性更强多病原检测The Ct value corresponding to the detection level of RT-PCR and MRT-PCR for pneumoc

12、occal serotyping SerotypeRT-PCTMRT-PCRCombined with other serotypesDetection level (fg/l)Detection level (fg/l)111331001004100105511610119A7101018B/C81010129101010101010121001014101151510118B/C1119A10119B/F101023F20101023F101033101035B35B100100381010基于分子特征MLST： Multi-Locus Sequencing Typing 选定数个看家基因

13、位点；针对各基因位点设计相应的PCR引物，扩增各目的看家基因片断；扩增产物测定DNA序列；进而给每各基因位点指定相应的等位基因数值；各看家基因位点的等位基因数值共同构成一个等位基因谱，从而命名相应的序列型。 PCRSequencingGCCATGCTTAGAATMLSTDATABASES62315272基于分子特征148株IPD MLST分析 74个ST4个高致病克隆在中国发现24个新的ST型别被发现基于分子特征PFGE：Pulsed Field Gel Electrophoresis基于分子特征基于分子特征 Stain Gel and Visualize Band Patterns A B

14、C D E F G H I 基于分子特征肺炎链球菌分型技术-脉冲场分型 PFGE Typing SOP我国部分地区肺炎链球菌血清分型与脉冲场凝胶电泳分型分析 ：中国疫苗和免疫2010年第03期 基于分子特征MLVA：Multiple-Locus variable number tandem repeat Analysis 细菌基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequence），它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。 VNTR-PCR：即细菌基因组重复序列PCR技术；是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。基于分子特征基于分子特征方法原理/靶位点优势缺点PFGE全基因限制性多态性相对较高的分辨率适用于爆发