地黄中水苏糖的提取与分离实验(共5页)

1、学院 2014 实验报告PAGE PAGE 8地黄中水苏(shu s)糖的提取与分离实验一、前言(qin yn)水苏(shu s)糖是天然存在的一种四糖，是一种可以显著促进双歧杆菌等有益菌增殖的功能性低聚糖，不被人体消化酶完全水解，热量为1.5-2.4 kcal/g。因而可进入结肠，并被肠道细菌酵解利用。有对肠道有益菌如双歧杆菌、乳杆菌有特异性的增殖作用，具有抗便秘和腹泻的双重作用，有防龋齿的功能，可通过调节肠道pH值促进人体对钙、铁的吸收等特性1。根据水苏糖的理化和生物学特点，其应用十分广泛，在食品、药品、化妆品、饲料、酿酒、工业添加剂等领域都有广泛应用。水苏糖的生产方法有天然提取法和酶法两

2、种，酶法生产水苏糖是最近发展起来的方法，目前尚处于实验室阶段。天然提取法是目前水苏糖工业化生产中常用的方法，经过研究和工业化试点，该方法已经逐步成熟2。地黄中梓醇含量、还原糖和多糖的含量均为鲜品高于干品4，本次实验通过三种不同方法对熟地黄中水苏糖进行提取，比较水提取法、超声波提取法和微波提取法之间的区别，再通过乙醇沉淀、大孔树脂吸附过滤等方法纯化，以得到较纯的水苏糖。并通过HPLC-RID4高效液相色谱-示差折光检测器对样品中水苏糖进行检测，通过分析数据比较得出不同提取方法之间效率区别兵。 二、材料及方法1.材料实验材料市售熟地黄（块状），每组50-100g，共1 kg。D101大孔树脂500

3、g。试剂1）乙醇 4 L ； 实验用品（以下为每组用品，每组4人）1）50mL离心管 8个； 2）50mL离心管架 1个3）1mL 取液器 1只； 4）1mL 替补头 1盒；5）1000mL烧杯 1个； 6）200-250mL 烧杯 1个；7）20cm玻璃棒 1个； 8）记号笔 1个9）50 mL 量筒； 共用实验用品：1）称量用天平 2台； 2）离心管平衡用台秤 2个；3）8-9cm布氏漏斗 5只； 4）封口膜 1卷； 5）8-9cm滤纸 4盒； 6）剪刀 3把；7）层析柱（10mm 40cm） 5只； 8）氨基C18柱；9）0.22um水性(shuxng)滤膜（5cm） 1盒； 10）计时

4、闹钟(nozhng) 4个；11）1000mL试剂瓶 1个； 12）5mL 离心管 3包；13）标签(bioqin)纸，若干； 14）100mL量筒 2个；15）蒸馏水 1桶； 16）手套 2包；17）1000mL量筒 1个； 18）500mL量筒 1个；19）抽滤用缓冲瓶 5只（与布氏漏斗配套）2. XXXXX。指某项具体的研究方法（如XXX微生物培养、PCR、蛋白质纯化、酶活性测定、蛋白质的含量测定、C/N比对植物花芽分化的影响、pH对YYY酶活性的影响等）。3. YYYYYY。同上。4.液相色谱。同上。此处所给出的实验技术中仅指具体的、主要的操作过程，不必写实验原理。也可以给出实验的注意

5、事项。2. 水苏糖的提取与浓缩-高温水煮法每组称取10g混匀后的地黄样品，置于250mL三角瓶中，加入提取液（蒸馏水）120mL，浸泡1h，然后置于100条件下煎煮1.0h，简单封口以保湿，期间不断搅拌（注意达到预定温度时的液面高度，以便适当补充水分以保持水分总量）。加热结束的溶液待放凉后，用双层滤纸进行过滤，滤液于旋转蒸发仪浓缩至原体积的约1/10，之后上述浓缩液于12000g离心15 min，迅速取出并保存好上清液（弃沉淀），该样品中不得含有任何可见颗粒状杂质，标清样品号。3. 水苏糖提取液的乙醇沉淀每组各取上述上清液（浓缩的提取液）6mL 2管，冰浴30min或以上，之后加入24mL冷乙

6、醇，静置1-2h或过夜，然后10000g离心15min，迅速倒掉上清液（弃），保存好沉淀，沉淀颜色呈黑色。然后在两管中各用纯乙醇约10mL将上述沉淀悬浮。相同条件下离心后，迅速倒出上清液（弃），保存好沉淀。之后沉淀于40-45干燥、恒重后，称重0.111mg。称重后溶解于12mL的去离子水中后用于液相色谱检测。4、水苏糖的大孔树脂吸附纯化1）大孔树脂柱的安装：取内径10mm、高度30-40cm层析柱洗净后（实际柱高=22cm，体积=17.27mL），垂直架设，在其下部装入1/4-1/3的去离子水，然后将去离子水浸泡、清洗后的大孔树脂均匀倒入层析柱内，不少于25cm，用去离子水冲洗（平衡）。流速

7、约10滴/min（0.5%柱体积/min）。2）进样与冲洗：柱子平衡后，使柱内液面降至与树脂面平，然后加入5mL的上述浓缩的提取液，液面下降至与树脂面平时，进样结束，然后加入5倍柱体积的去离子水进行冲洗层析柱（此过程称之为洗脱），收集5倍柱体积的洗脱液后，洗脱结束。洗脱液体积86( Y ) mL。上述洗脱液中，于每个柱体积取一个样，用于液相色谱检测。5. 高效液相色谱检测水苏糖层析柱：氨基(nj)色谱柱，250*4.6监 测：RID。流 速：1ml/min。收 集：2%柱体积(tj)/管（约2-3mL/管）或者(huzh)见峰收集。流动相：乙腈/纯水 7/3，使用前需过0.22m滤膜过滤。需配

8、制1 L。样 品：1）最初提取液；2）乙醇沉淀后所得的样品；3）大孔树脂吸附纯化后所得洗脱液样品。三、结果及分析1.实验结果（2-12-7为本组结果）理论上水苏糖样品的峰应在17min左右出现。备注：标品1的浓度为11mg/ml;标品001的浓度为34mg/ml。不同图的纵坐标不一致。1-1样品峰分离不明显。1-2样品峰分离效果显著1-3 没有峰1-4 样品峰未分开2-1 没有峰2-2 没有峰2-3 没有峰2-4未分开2-5 没有峰2-6 样品峰分离较好2-7未分开3-1未分开(fn ki)3-2 没有(mi yu)峰3-3没有(mi yu)峰4-14-2 没有峰4-3 没有峰5-15-2 峰

9、值为负。5-3 峰未分开标样 峰未分开标样 不明显。 分析：1）指本次结果与理论上或原设想是否相符；2）本次结果同其他相关研究结果的异同。2.结果分析从实验结果可知，大部分峰都为分开，只有1-2,2-6两组样品结果较理想。因1-2组属于30min水煮，对比1h水煮处理，所得水苏糖浓度更高，提取效果更好。 根据文献记载，超声波和微波更容易破坏细胞结构，故提取效果应比水提取法更高。当然也有可能是因为没有摸索到超声波和微波提取法适合的条件，未达到最佳提取条件。 又因大部分样品未出峰，表明提取液中水苏糖纯度不够高。判断可能是在过滤膜纯化时，水苏糖损失量过多，离心纯化可能有更好结果，3.思考题1）文献中

10、提供的地黄中有哪些糖类？答：地黄中包含(bohn)的糖类有多糖、小分子(fnz)总糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖等5 ，。2）在本实验结果的基础上以及理论课所学知识，你认为(rnwi)可以用何种方法或技术能够获得水苏糖的纯品？答：对样品溶解后进行活性炭脱色7处理并离心除有色杂质，然后用葡聚糖色谱分离或用生物膜分离的方法去除其他单糖或低聚糖杂质，得到水苏糖的纯品。3）根据生物统计学的知识，要考察提取温度、提取溶剂/物料比、提取次数、材料粒度等四因素对可溶性多糖提取的影响，如何进行实验设计？答：实验有四个变量，9指9列,3是三水平,4是四因素，设计一个L9(34)正交试验，将所有人分成多个组，各

11、组采用不同的提取温度、提取溶剂/物料比、提取次数、材料粒度进行可溶性多糖提取，保持后续操作一致。 四、结论 30min水煮，对比1h水煮处理，所得水苏糖浓度更高，效果更好。在提取过程中应注意避免水苏糖的损失谨慎操作，以及注意标准样问题防止出现不良样品。参考文献1任宏强.水苏糖J.精细与专用化学品,2003,11(14):15-17.DOI:10.3969/j.issn.1008-1100.2003.14.006.2尤新.我国低聚糖生产技术研究进展J.食品工业科技,2002,(4):4-7.DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2002.04.001.3梁蔚阳,冯炜菁.高效液相色谱-示差折光检测法测定注射用转化糖中果糖与葡萄糖的含量J.中国生化药物杂志,2007,28(2):116-117.DOI:10.3969/j.issn.1005-1678.2007.02.014.4李计萍,马华,王跃生等.鲜地黄与干地黄中梓醇、糖类成分含量的比较J.中国药学杂志,2001,36(5):300-302.DOI:10.3321/j.issn:1001-2494.2001.05.004.5梁丽心.水苏糖的提取及初步精制工艺的研究J.中国食品添加剂,2005,(6):25-28.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.20