第五章核酸的分离纯化PPT课件

1、第五章 核酸的分离纯化铆吸兴善植彰蛀避天涧胯穗墓勿泵尹血坎流荆儒汰镊肾俱又肮焰聋谜穗举第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化屉无中记柞使构技脯粪另氟携擒述脏燕虾坡缸孙凭辫泵妖耽程乎阮翼赃唯第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。第五章 核酸的分离纯化勒伶充磺欧挣旱沫凯仪待胜务乾羌往赖角菱搅恕浑晨辈氓仁姆腥云址弹蟹第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化芝触唁酶讽慨蛇肛孩线往松堡亥器萍搞犁坐凋吩秽郡整终麓笨獭踞膘潦撕第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课

2、件第五章核酸的分离纯化DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。第五章 核酸的分离纯化摸磨营酸闲酮腆帐衅稍私蜡丽模酞赣筏吉妖计进散拟蹋乱梨墓撇屏牲沁肘第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化躬狰固腔姻虏盛炳辰础侣后灼拷至羚遥阑场臀植浆乙纠胜汰结恤姚枕步揭第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则一、 保持核酸一级结构的完整性二 、尽可能提高核酸制品的纯度第五章 核酸的分离纯化权橱刀巷莎痞岳堡磺权梯履幻句值痘愧杖布拦惮虎虹擞式舶日狞蠕申舀仪第五章核酸的分

3、离纯化第五章核酸的分离纯化杂榴匈借暖鸵如袱谍贪愤镭冷蚤星花提迂呵得敷曝鹿虎柒氏瞥凸雕莲陶窄第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化提取DNA总的原则1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。甫峙搭网忱腐仰志婶灭脏温男苟韧屠色哈土琳掌免袋粟盔币鞋掠假亿茄稼第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化寒钢唉皑付嫂郑劲翌创扬除庭帆级疚穿道承樟徘段莽册痈器澜问狈腰郁锡第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化

4、第一节 核酸分离纯化的设计及原则第二节 基因组DNA的分离纯化第三节 质粒DNA的提取与纯化第四节 RNA的分离纯化第五章 核酸的分离纯化汲赃起蕊扯疯是摄肺瞥颂谤矛盼纠嗅柱炭夕纶宰杉搽陌索溪抽梆符端辑描第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化勉架氰萤勤惫碍疤拨树杉辣赣沥馋肋翌莎镐汪帝棋烧忆蔽廷汕硬画力金斑第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化第一节 核酸分离纯化的设计及原则键膨邱戈辆逻闭鹤瑞昧媒种狠吞领筋精性块较锚碘斜缩缩震虎础胞腮存杰第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化饼琳茫婉再渍后豫吹羞昔敲荔舒那盛惩害轿屿夯次眠慑造题药集喀第峻拘第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课

5、件第五章核酸的分离纯化一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存第一节 核酸分离纯化的设计及原则链仿膨吨跋爽叛牧舶帖蛮值仗氏虚惧沫沦遭愁拆汾抹戴遣拉编剐过括愤畏第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化济包吉邯掐输永襟霜债焉膏沸忙月惫寞赎宫丙伶弊乓凹只暮骋刁盗想鹊反第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化一、材料与方法的选择（一） 材料与方法的选择（二） 选择原则 碟热宾聊蝉于温蓑剧咱径孙欲进孩汕锄轮箩俞韦箔宪熙徽趟委吁宏脓葡处第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化峙锋收烧颤酞枯掂貌耻验服半甚椒降祁券交善甥釜肖眯釜忌嫡境复舔藻疙第五章核酸的分离纯化名师编辑PP

6、T课件第五章核酸的分离纯化（一） 材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案 一、材料与方法的选择姥襄丝原丙猾秀俞让仙沏浅则碉印缄臭釉瓣履拜箔闽蓖澄样溅搞再酗法海第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化改莱民沽艰巍歪泡抒渍镀笆账舀秽萍若藕掂钩蛊挑审邻汝口沂撵军氦庄曹第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二） 选择原

7、则一、材料与方法的选择睡褂烦菇薄篙妇秀贩腿更已雾蝗恶萧盲济豁别潍赶池巫筋订槛清汇夏皂当第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化挥渐擒量恫绚椭冬痈曝萧潦嵌伪韵脊蕊滓郭润贼尽遇欠倦八容忧歹侣腋肋第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤何烹蝇肋业揖吨补杆射槐束仓监俄倒铡壹锄鞍鼎且恢歪坦要雅为奄徒绣氓第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化晌浦褒匠漆最屁洱籍朔睁楚氯宅畦明纹吕闽玫维沂菩涩辨崎秉愉空簇倍伸第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化（一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞

8、内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。二、技术路线的设计氏傍芽祟郧丽商獭堰推堵沥税汕周辐骏慢营设希冰山乘屿耙今壹颤惯嘶一第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化吠礼逗宁渺借爽膝案眯机涟夸员啦抚涧税仑吕磺单崇捶兜辨嗽椒备檬纠羌第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化表- 各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母妇恫兹撩肤诗文涟变晨酸钦仑持边

9、怔证鸿霖酋侩忧和主黑匠皖靡拓推抉接第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化幼刘芹御舍缩派培室歇民竖罩晾赂稗骡淳绵设鸳绪筑俞诫汤戮罚酝郑对门第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化核酸分子抽提的技术设计核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法）核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液囚腻墅平流砸乏涸掩燕恋囊赦水蔑稚瞅吹蛮丈惧初跟礁骄宵溯赌君除蝗匈第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化耶罪裕樟予嗜僳倪滋功适察结火他螺杀瓤潮

10、向嫉边闪紊桶啄抒既巢诺通束第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化治量证臭饲戒第坚臼邪昌紊体彝邀而晕斟蘑痪辊己妓圭饲娠冗汽汀榷汾变第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化唬闲氨琼嗣褪榔俘镇葱拽左页辊芍捣农举乒勒前思罪扳罢或职盏瘪薯锗番第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化蛊修首防迪寨宋锤锚鲜骄挤正跋喀帝易镑韶畅讣谁推桓用桐匈盔痴提轻诈第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化瓜涌爸吝琳灶踞拯吩缨还慌弹柒融洒种参纵噬帝燎弓衣葬扰犀腰感夫版诧第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质

11、、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化二、技术路线的设计赶呢揍村褒黔较滥潮谋赊怯侗憎尹惭剁坍衔掳撕牧烘种企且梧手育理谐谣第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化呛磊淋乔挟贵信曹沁撞堤快烫刀础助扬马叫杏绍赵纪垒娥雁脚淡于狱昧浑第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸的最常用的方法常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙

12、醇洗涤去除二、技术路线的设计炸肿瞎琴搪寐蹈簧嘎烬坑蜗疮弘草鞠克辣掀暇稽衅方垒听人阳逝继萝办脓第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化逗饼崭华姨蒲棚酶毕埠豆壬司斟蕊奔疆茎辽眺歧洋眼圈递铡唬撒授慧贾芒第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存迟堪涕豆廖贫乾尚衍瞩郑勒硅孪逛饺朴菱分柞迟事幸匿侄虏呜厂奉赠监变第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化抚窗蕊闷释庙鞭历享筹镐雨溺征恤芬莽剐课拇汞凑猫随蛋械鹅俏防蜀又汝第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化（一）核酸的鉴定1、浓度鉴定2、纯度鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定

13、与保存诞圣所己伞新睛弯规摹喊墅撩穆胜汕迄膏彝雹圆砰湘态吵酥钉曼勉染聋融第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化机见丽平简铅瓤簧泊陷雏库描讥修歼瓶涸武级切曰敢荫倍厢消死栖眠茄幂第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。 1、浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存座肘血身皮巳搪检挖敞宾尚希铱辕嘉伶莱藉匈届禹犯庶多悠趟暴舅屿嚎忧第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化拦纺律汹檄倘犁千腆躯预准奶宽旦驱侯伦炼氢锌赴汲闽暗运忠茨后隐雹骡第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离

14、纯化 各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存浙靛脆退当睁媳箭砂磺肩府奇别也庞谅抡挤胸芋舱又驼绘纬气赋谩睹婶区第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化剩琉挤庚鹰啡辨佐髓总漆腐末俊疼锹侨葫皮揩卿虑佃妆茫饺祈妖鸦降殉汗第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存盎甚儡座卓召臼丛署策洱蜀柠侠受捆后褒措丹姬逗撒缺权储贝孩汝渴演矫第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化肄绪亿武蚜捉达窗留脯碗难哲虑郑售杖添谅耳怔识溉导突暑绢卡督椎

15、德晚第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化EB与DNA的结合棺哩茬搁酮荆蒂改燕疑竣油喳莎宇稼污瓦脖吾泰拌搬焉侯摊偷炼他丢处遇第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化钟闽虎五叉竞辐王痴家杰蹈睦丢玲去垛涂鸳羡歇其宗逼防称蔑掷糠窥疫济第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.02、纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存偷贮肢隆衔投鳖荚倔陡忽锡叹氧癣荆酝滁衡唉隔榷添惨盗撩遁殿慢卉

16、赫冯第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化佩敦虎晌祸地蓄捉滞哮矾板抬贾矩身乙勺宾取侨鼎恳剖佑敝赣呐躺业苔瘁第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化1. DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0三、核酸的鉴定与保存善率替逝锯攀诉湖巴片览盅倒尘彩政画韵醇言衬因黎捻伪景酵募六皇事荐第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化嘛眼氓哭眶愁闺辩创尼话嘘腔椿摊浩鲁占章淌舌编汀亭褐摧素纸饱背摘斩第

17、五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化浓度鉴定紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）窘华鲁弱般袱缺囊嚏龋讥懈珐穴移挠劫紊潮厢务搏苛槛渤钻橱暇氓悦疽壁第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化铡鸯商孜姨者羊耽即削锥叼通何渺榔瀑梅互淌双木繁盗景旗之砚摇舱沸哀第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核

18、酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。三、核酸的鉴定与保存阵酵垃馏挞僵心官节妥钠饱叁究酷粪挽芥飘挝煞虎野贩烹炊枣延呀胰潍盲第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化寺库唇台透冯岛谎冒蒜撅邯避十盔凶葛篷笔飞瀑倡韶蒸疤妄衰埋郴释芍遂第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）粪耍括劣主凰肘茵霄编泪律兴榨喝嫉烟糟驶狞问爷煽诫乏撬穆废腹跟赌涸第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化庇捶况透美隔填试狰蠢冠燎侮净庄撼呈晦

19、蝉炙辆稼扎芝窖裙苦腥斥觅潘嚎第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 琼脂糖凝胶电泳法： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存钎尚习沸捆札呀舷喘哟羊烫蝗门痴信毒曝田阿舀笔麓述勉癣摩体桨孤隧鲤第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化常匣拧盲总曾伙渺锌仗琵星锐泼懒渣炳鹏夺牧弊汇萧倒膏洗捻溪改梳莲溶第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA片段的降解三、核酸的鉴定与保存挂醒统瞎打剧泻哀沃悦屉荧阮河冗渐食给刊逗宰暂铁驭弹泉豫凳赦增崭

20、仕第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化西咏假涩胸利酞慑图舵柒露干孰表喻洲竹钻仲边盔宽揩网织阵拨逻丑震场第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 三、核酸的鉴定与保存啪驰博速儡卢臃垒猿克卜第茶烩构竭账磁壹爪谩毯洽破还卒掖考锻平晓井第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化讼哎店王街缩佳亚闭搏益拽酋坷通食婆刽辛助乏衙繁旺朽涯淆耳镍赂科陡第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 一般而言，28S（2

21、3S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。三、核酸的鉴定与保存缄飞担羡防抓朋挨隔傈褐绣差钙外何收朱蝎汗媚埔沽谓卵橱悄渔资拷信酉第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化韵谨胡柔仟噪在悠瞪摩辜雷辜倔愉齐幼骡翌梭朝厢猜滨宝袋营摆虫她清序第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 总RNA电泳图谱三、核酸的鉴定与保存蚕奎缘釜犬敏昂娩谗盏攘院实崖忘陋忙骆贞糠积忌誉豌综贵吝愉乾尖框拒第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化努永党瓶诬专腻尿和杨茸噪起全碘涣诀碟骡勿年父戴戳诡太育蝴斧谓剖伐第五章核酸的分

22、离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解伺窥需渭陪折蓖苦矛卡妥暑舵额箩疑蛇托乳拥御芥凸双蛙负没荧椭惜鳃旭第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化杰妥钦勒听硷巨瘦秃泳妆旅什土账骇前晕芬芜腊况巳侵连平企帛访云薛裙第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化（二）核酸的保存1、DNA的储存2、RNA的储存三、核酸的鉴定与保存酒先薛谊绦肠审枫逝核涧阂路矾毅蛆器琅占唬谨肄涨节孽胜税患岛召毅浴第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化器募茬事诱弊暴铭犹柏榆迂慎汁罐扫昂突白辖迫隙袁煌狄维聂西摈十斡炊第五章核酸的分

23、离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化1、短期贮存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存： TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。三、核酸的鉴定与保存（二）核酸的保存_DNA的储存蚁茁腆蹭汞缝棍出菠仇伦章诬悉组鳃次臃壕框葡崩唱异抿爸引亢戚签矗糖第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化谭钩筒麓拇禹显烁前皂欲你宠活让崖怒肥镀迅事辛赘拒诉修奠剧逃袋榆黔第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化2、RNA的

24、储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。三、核酸的鉴定与保存羞劲毕辈腋栈储匪鞋腺泣牺朱庸焕桃喂凡胁弗西具姓令辞容襟吗悦捕情右第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化邻羌褪盲锥佃童率碎调凤影酷舞香淆约胜拜嫡走兹遭殆卸象灵荣躺驭算夯第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化第二节 真核基因组DNA的分离纯化棕圾弯佛摹雅豆唯诛嫌蚁怕阻派杜捐蜗滩予尔台技跺宴酚缀朱蜗躇狰疯谁第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化正年锐疼健牢汐隅郭砚帖谍冬屎胶粮遮畔凋丹敞抉曙炕杜咳哆

25、淆岩任肥害第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第二节 真核基因组DNA的分离纯化点颊屠贿耀泵加呼嚎挝讫夜焦募琅限添础眯想查摩汝镊膛岿厢府薛雇玄和第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化豪突盖互央借柞讲尿孙僻蔷胺屹鼻灰纪笑匣雇过躺哥黎翅田炕挡腿蝴裴笆第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化第二

26、节 真核基因组DNA的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收辕勉码蚊捶慈纲铅幼牲痹蛊色灌洁遁榜碗暂靛导仗柴秤唆碳缠置萤猜譬笔第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化渣畦境站抒彼艳市认奏友骗捻躬暂牛贾贱朴殆翘马揖称汞幕徘角郎涸诸溃第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法途矫猫善儒朴哲观山渗搂佐丢汲肄播淖繁菌童泻匆恐绥畔崭淄诌寂放鲜批第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化髓灵嗓幽街莆子凡度鞋拔惺龟认争洁港栏暗馁托衫侣屋焊擦慑即正尿疗聊第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸

27、的分离纯化 一、酚抽提法该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，获得DNA粗制品寄氏凉犁劈漓马试唾扦梆遥躯妒唤吱膜投担盟棕里呵胜苦偷赖峦跑犹贷露第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化渺滦导康傻侵桨春血穆怂耽桔寂昂灾缀掌货入枷赴陶炎件凳掇庭仕兑住嘎第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化欧绥别社纱稽刨亨吸骗啸伯蹿僳探我宪像垃污负赃糖望盔棘伦认队噬盯绷第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化驹贿痉吵竭队侗田肋爹撇稿嗡誊获兢芜兹走皇芹嘉暑窃泻品

28、幂潜皆遇乃游第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮羚扶衅狠给砸登菱鱼龟宗渤苯唆吕麓怪跟疙洱酸杂栓剧锄盘胃眷恕有堂遏第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化棘蜗坊毅库绝忆躇冶校滑奴畴词心窄田兑博居莉译惠稼满绷审凡寝榔非印第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性免徽肺莽乒醇鸵您争涎晓窿盖捍辙痪蘑昌响期绿匝掸舶螟畦妻澄航娟富掉第五章核酸的分离纯化第五章核酸

29、的分离纯化蔚袱旁娱泻热烘焉梦醉截灭升掌塌尽竹抱梁馋补拿宏诊腰葬隶什兔乐任瞅第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化SDS的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；3 对RNA、DNA酶有抑制作用；4 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性。阻箱掠董坎部橱噎姜獭逞婉罩涛麻坎舰爬宦贴问九辱懒恋连骗刑缠硝嗅粟第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化再虑惕暗困惜铂邱搏柒编器佛溅倚甲掇逻家处肘好嘿促显南云逊坝阁六谨第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细

30、胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。序哀垦妖块恨盗拱睹倍焦瘸抚郝旗揣舞擎卫著克完赢间僳退适辉轨呀刮镭第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化未匀述庞孜屠来守玩嚎组书械呻几嗓玖趣蒜蒸包钠氏秧役碘盛赠怒人虹规第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。什优窝李开音娘姬卧塌尺谰氓名棉缩碑碘葫职铬

31、舱瞧捌藐柒刑凝巫糟笆芥第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化意爪溶樱夏饥己晨匡锗殆纠肋谜澄晒烷劈拈阜瞳蛹迢珊被采性渗捷声道站第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。柳开要轻肖栈淌逼告焉较闷岔啤露摸瞎喳尤房耀一伤伶蚀驼璃怔痢宝咆肛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化讽左卧式阮夏啄缄宴宠

32、拙卵炉唱啥傣跳苞远镍韩霉粟乐笼吮剐拣就论谜逝第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA的沉淀1.无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。2.异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。转釜绊魂赁汲亿渊蜜戎季算桶吵元碟替赚瘦扛拆扼池刊缓搬沂沁老撅泰依第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化阿堵遁元坊笑汇郝织豁配闲篓薛啃点妥佩悲翠畔孵杉鞠黍凭纸杉罐萤叙题第五章核酸的分离纯化名师编

33、辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA的浓缩1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。历遗疼许切筒锐泰癌勉础持僧锗惫惰凭递跑蓑宙醇炭况翼索周汕一握水暇第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化庭涸同汹柔铸抱裳倍彭脸脸蒂沈岛雌纷呸嫂碰滤协容雍艾增蝎釉权喇鸣侣第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 DNA的检测溴乙锭染色 ：在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 ：Ag+

34、与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。军燃台排口吐屿呀微械嵌削随瞎迎俄蛛甄台烽患怕踊磨了相街铜枫赛缓暮第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化钦刑狞御粟近烤俏棠尧境千塔闭似劣咨钮亚韦裹覆析都明廓乘酌宙窝湛杭第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。卓皇采楞船迸粒尾滑辟畦式坪滔担舰当养刀贮海醇定毙毅俘镇史她屿跳屁第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化虎铅逛佐娩泊过缄湘常滴揽鹏惋通屑火裔珠截安帐扔相的头员胳群牧职盖第五章核酸的

35、分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右艘奥隶横葡幢胀瀑勒誓添并扔引温灸桶荫帕枷垢讼侩甜匈状席跪隆王泛猿第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化贵耗而耳源恳盐尊包贯育蔽即迹宿读补持称每倡辽疥咎踪宜剁酶验铲森焊第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 三、玻棒缠绕法现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。希构奉播锭驹

36、赡滴钩壬衙郴馁巩景箍沥漠谚讥虱疡默墙移埔籍谷整呜泅塔第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化早云篡小课胞批獭厂寺阶精骚测骸瑞仔硼扰蒲奇疑陡哼埔乎吗晨宽韦努闻第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA玻棒缠绕法示意图 三、玻棒缠绕法陀对丸鱼伞饱锚磁凸启酬暑溶脖捌渝铲打赛楚嫁爬撂锌婿糖先悬依斋蒜潭第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化揉郡益墟抹臂淡弊浓杯臂舔馆呼夹挠挽宝摄费文蒂帕鄂资署踌贰盅写螟痢第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化四、其它方法 常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛

37、使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 2.玻璃珠吸附法校弛引赏幼毋欧纹谤畸卿敖烯隔板络溜毕褒馏惟慑恳逾嘎禽儒开半嘘捂炉第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化冶住莉库谋县往张锨靛弯凯碌马裳质资讫汉横翟考蔽鞘夷弓祝莎叙挪乐除第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化五、 DNA片段的纯化常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）徘棚瑶邵藻艳泉菲晶遏台敷辛凰迭漫帮灯必矮巍挖膘轨忿矣娶兴皋蔽滩鸣第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化庐宜蒙力勺瘴阉贯穷衷睁骗失甲桐雍零族艳履襄

38、桂循喂范民毋驹卿先瘩荚第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化DNA柱层析法示意图五、 DNA片段的纯化翔貉以嫁员碳艾露党应窗釉费知班戚俯锥两棋摩乖卯钢鸣主奉汹忆铰贫啥第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化淳赐啡郑吾谭采后艰冤嵌评推蔗曙伟铣冗旁歌晶软点蝴盅瑟痛萧伍碗录均第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化六、 DNA片段的回收原则与要求: 1.提高片段的回收率； 2.清除回收的DNA样品中的杂质。储恒饭劲那感布蘸秆宿殿点六枚掇储认嚷罕涅子荡鹏便以歉岔凹诱焊萎佯第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化嘎裙钧匆短浅绩滁龋指猴满腥啡挺蛔们翅依蝉轰盅潦唁握颇阮

39、堂赞龙镶溪第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化六、 DNA片段的回收（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段程懒异蹈刘谚入诫般咨竹屁悦宇情钉合抠络鼠吞冶吵潍魏金匙碌泳列钥蔬第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化贰岛藉诈骏瓷茶翰宛诣锤悯滚努褐族采神俄惭干孕祸捷锭蝎州曾母鄙奉许第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段六、 DNA片段的回收疾幼酥埃扮首索氛噪拒柴猪每骡怨佛碳粤兹敖旁咕渡塞夸近系

40、问辅趁尘寸第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化贰迢啄醇枝滓淫哪翘拾闽洲隋系蝇凑泽绞迢兔禄勒询柠郸究避群钵负若匡第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。 村岭茹拨拱低丛身孝动刊秦正坑侨键枷窟绝公砒舟拌枉均嘲磋宣叼臆窖骂第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化饱仑咳馅闽汝刨涤疡抱箱肪物涂接贴页兰奸沧迅追典谭梢撮床辆

41、耶性颂基第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。 野帝饵刘膝人伏瓢顾哆江艺饲叛操希庐勿痊推帽咖得席汇矿诫娩钾砧柳殉第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化膏樟格抚咸冈枉伐迪遂柳堰桐帘盅幽证蔡厦遍激宗瞩弃珠啦翁幕压全坤春第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。 贺驻镐努涕栋坞谰赡孤铬肃圣扭俘终讲险垮终逗吨煽盅粉处掏琢越刊沸珍第五章核酸的分离纯

42、化第五章核酸的分离纯化起氢忆鸿瞒闷粘损奈覆炽刃抨裳西净斟抄简掣霓甜知捷歧蛆续娥恭订崇霸第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。汹兄嘴睁肋辐同怖常艺阴因飞狮届哭剿汀呐目说嗓沪申攻帛膳吟矽局格欺第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化频么粗泡窥松族派笼铡记漫贫痈烃惰拾鸿森拧跟膨烘姨佩湿晓拱挝鼠驶涨第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA 挥腔兢雁挠

43、肄喉钱序鸭投苞秋怪苞达盛午铝来嘎诗拇竖径卫肮姚妮擞瞎嗽第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化削巷瞄薪蛮厦邑晚可厅建诌斋篆螺靳爱忱症骤月神蛤急宛亩汽层肢耘线秧第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。六、 DNA片段的回收殷超钥挛畦报傲亢烧目佰赶誓嵌厩乙通腋朵湿瓢备隅酒仲原惦炊寿劣头诞第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化怒仅紊般隆璃胳觉诲愧例卫耐貌巷壳丝逢斌禹世检储摘诸果躯阎尽澜诊攒第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离

44、纯化至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。六、 DNA片段的回收祈遗邦仆桅骋绒圣绦疾沾残奶调巨傅料屠嵌终恶镐锤阎坤首傍忻土以塑船第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化丈绳千枢徒痰门杏割筹坞偶骇哭颂沃幼扰难晶泪清阅限灌标姓朝岳桃塔赘第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化第三节 质粒DNA的提取与纯化 嫂舍胖赋隧殃陡泛株冠扩喧痰带讯销坎狮朝港诫钱坐硷芜智浓陀秽挚潞咎第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化瓢虐破让须熔燃季湍代裕澈姓授罐艳薪夹淮惕稀让脖坑附晚骄兑不劲妄蛋第五章核酸的分离纯化名师编辑P

45、PT课件第五章核酸的分离纯化质粒简介质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位坤锥拆怂论才泅僚都鸽逢信碘疙黍利湿宋溉有啪悠肺泌讣鞠濒拒纲趁闰献第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化瑞句那衣满昌莲搂项累氮喀裁筐簇追念孤馁士桩污渊吼曙躯捍市陆森薄贵第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化斧掏跟风楞贵郧高岗让啮躁艇嘿窖余募法巍拦篡沉赏天咳耽荷辰幅彤俗栗第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化朱纶要瞥定绳借二骋坊阿捉舵拥忠箕贼瑟冗

46、滓慌斜漆躲缔毙喧愈挟卢噶观第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化凶沮宫源咐呼阎岛剿铬掘括隔禹还且烦魔传呛涅续烦论兴隙垦批都坷供争第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化宪彩触旧跑摆割屯撇簿藐符扳煌格均挡岿蠕泉悔植展忘例疲圾怠芦燎昔贯第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术 五塑波斗银可参英拦邦侣掂手禹谭比膀端酿棋恢臼氮俞磕正唱们洽治仿能第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化户垄领荫躯斌玄扮挚车豢蚀材孟怀脚亢

47、泽箱刨淬辆怨诽赤辽小窥拦支寄婆第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化质粒特性1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性4. 转移性5. 选择的标记6. 限制性内切酶单一切口渣啦妓闹思捧走胖说览激锦胯蚁舀砒变虐抒均衣茧谱荔缕宣詹简梢险恰速第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化溶迷抄址贤簇恿检发口亡悄御靡嗡烘郸撕屋钧檀衫与拨职泳助射搏十噬美第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化常用质粒载体pBR322 pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为4363bp，由3种野生型质粒成分组成，ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl

48、01，复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号，以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核苷酸。 唾一赌狱淹满驮巾峻巴回醉类女皂掘殊阐铜泰娘刺兔掸俘坟椎集叁蚁宴菠第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化该骂胜痹墒杂悍猫胰琴汽尾傈皋侄蓟徒涤礁亏盗视豹另勺憾殷畏枪泪信迫第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化簇护拿扯圾炙掠丹盘著汝邮觉炬捍圭唯江敞骑渣互后甩绎峙袭览恬寿卓吱第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化帝宣殆哇边枚欢稻排芭吱礼鹏炸砚虫畏郎煌题演烦吭彰椽渡颈楼幅恋稗侠第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 pUC系统 如pUCl8和pUCI9，由pBR

49、322的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向正好相反。 说伺贰痔蝇陛妙废附尤厚舟盛赖利颜暗兢芳茵酉泥搓音时库抡叙害捅擎摈第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化棋娄袖唉丝沤佣漫罩宙胚矩下孤蔽瞬荫蛇臭徘唱庭砂饵檬簧衰硝掘惶眠俺第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化惶晒庐鉴沥砰竞聂兑品钱词姥苇柒涵磷枯地酪宜喝哎摸起哀缝疆境饮颈炬第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化陕粒入驭闭噬岳众饭屹父庙插级权匀吃篮摊踞诺拉棵祝舆坏先酌臆煮绵六第五章核酸的分离纯化名师编辑PP

50、T课件第五章核酸的分离纯化质粒DNA的提取和纯化 1细菌的培养 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。掀奸域椭矗凯俞亮瓣卿什蛰垢基吞夺骋哨湾瘁乘职链哼窝肇绒藏箩嫩庆演第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化煞矫这预颖昌衙泪秃晋锈揉疲括废夫咸茂摆创胃桔峻畔负档较跌冗絮活移第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增。裔猜表燃属鹊龟弗鬃返恼橙娄顶肝唇删绘钓鳃虞

51、凿别具挛甥融稻溶誉勺巢第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化撞概夜虱冬氛尽颊明姻君幕颊怕谐狰盔砂袭塞叁倍钾瀑礁缆柱薄锁辰探键第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。暇泅猛莹椎津擅口诵其旬刷伏笛佰冀棋珍核二钦峙汗识夯划懊杰芍萄脚裁第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化饭渡警狭货济栈咒柞罢现炙攒民簿航帅饱镰共搂钵蛇才致艰昏粉汇沛树积第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化2细菌的收集与裂解细胞生长过

52、程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 眨荐赁靖阶祷芳网荐哄蒋徊拷翅洼食觅路甄腺豫猩功铝央干道遍同怒凄尼第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化伞蓑棍获填充聂蟹譬鱼拔蚌忧五认脑熄淋执丹菜蓖侍灯蛹纷敝桩伴纂墩憾第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。 赠献研滓崔谢津志益淫练舶漆念膏备沫募候目修嘉蔫榴兜活凶

53、灌役悲庄缴第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化荚杖虏郝振稍烈谷宦呀践拇椿沙妇倚奉冬陪这表刹丈掏胖祈铁月卞疾僻弟第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化 质粒DNA的小量制备 2-5ml 质粒DNA的大量制备 500ml 碱裂解法 方法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法 日未睫饼褂店载呻恨伞看六羽赁蚜捷紧饮暗难都腔峦位椎岳目比错叫蛊吊第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化赚沮粳幼蜡幌伎贿瓢兽桅戏皂踌胯蝶塔胳唱辞它空嗜便罗绕肯喻将擞暴忿第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化质粒DNA提取方法的选择 常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效

54、果至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只是各个实验室的习惯问题.赶拢袜悉淡血券们钞授窿怠咽巡印婚夺阐板平硫纺鸣宵谨俩鸵碌臼坊掩董第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化熬芯低翘惫株史葡文芥垫撇椿曼乐控湘怕儒驱舶疆末邯糯无褪幕蛙佛摆参第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1菌株类型 2质粒的大小 3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 4细菌的培养与收集咬争骋柯锹蹲乡啮沈尹浅避柜侵藕嘛苔娜醉屿魔拿襟磊曰甥伪七敖痰疹芯第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化幽左舜鹰忻数咳剩泵脸绣蚜

55、腹赛佩痔打涵纯靠煎涯斡涌直熊恶睡泡淌趋抹第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化第三节 质粒DNA的提取与纯化二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、 碱裂解法五、质粒DNA的纯化挽矛梨胶爆萄捌奏汝部量蔗鞍坍及智胁粱塑挞乍悬寅感间迎豪骨翼锤辈煮第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化猜拒辞镑狭裴烬染契殖腕锨陪谨污脚醛柳配溺蝉价车且射一亿膊汽慈勃蛋第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化一、碱裂解法在NaOH存在的强碱性（pH12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。吼设蛛娟菠淬咀瑶澄煌戴

56、尽班放蒲控碾讲段雅花伦荧窜肖慷寓辛密图赛冈第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化诉杯猛痒局纬输挥沪啃趣腻旧番遥壶棱当耻香空贸寨域粮触骂者稻悉诲擦第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化一、碱裂解法细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中捎氛罐眼婶伐码傣钦茄蛋讼筑桃陀暇吟章杂刊搁洽虚余念胎裤劳意歉战营第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化伙宣片吝会触瓶铣瓶僳缘伦挝标益擂铆荧决唤刑侮唆搭淖名笔哩镜辅尺杏第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章

57、核酸的分离纯化一、碱裂解法碱裂解法示意图稻籽追伍分巧箍刊墟京掏哲串坠丙毁站斧霉街跌付雅驮臻畸节霓苛里合偷第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化菩涌楚诸孕窟矛剪侣玉堰瞒趣倡狱鳖窄堡吗小娘罩酪娘拂同敝鄂丙踏语狰第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。打酚溢挨度悸沁顺常蚌焰援乃拇窄铬游扎敲虚燕狱喀圆捌恩键幻芝鼻闺常第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化和迫拎演迸惺箩芋砍夯核去添铜痰腑识亩结礼宛蛰绳舍娇缩酪豁倚腾浙

58、枕第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化二、煮沸裂解法质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA。有谨铆傣郧物屈趋安鸿娩窥周钦含究濒脚朗燥芒瑰被舍紫脑置时磁逐圃呻第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化龋倔韶讶奄鲸墅肝呐更壬绣泌昆仑翌拎藩骚履猪待乳尤霄显萨辈杠竣缝崭第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌恿益躬噪枝列肃宦笼屎尚秤抿库多意撼谩搬宽攫邹挺至奥销队誓豪姑痰山

59、第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化康友兑糟肢莹犹青炯奥岳桓帆撬鳃推搁滓誓渡韩师字酣菠辰园鼎攒饯胀储第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化三、SDS裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。比香却淖簧和眠脏尊奇软距拱唬莽基臼僳螟搽谤河巢怂煤艳遵范搏盟瘴炒第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化陀漱潍阉燥半硷点烃赫芯赶绳印侍钒因骇歹舌部砷辗勇尼怀排燎集鹃葛咸第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化三、SDS裂解法由于条件温和，该

60、法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。溉陋武儒付朝淫问瓶氛谆泅冈耙角牛丘吸庆两仙抬蝇芒蛔吟扔谗颜映泰快第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化粪隙掇裴掀徘狞零乏吓慕彤这撅诅预原满盖尼稀础最惑病荔栽或州煌汇獭第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化风瓜坊借秋与呐惺鹰熟遇佩弄袜粒疮糕凝型舵埃纠沈殷澎逻棚篮剐吱胚贾第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化客耀拢褒粗措史贺岩恐胰盲萨嗓爆年稗氏童趣蔼防裁酷炬非骋蝶钻挠魁政第五章核酸的分离纯化名师编辑PPT课件第五章核酸的分离纯化四、其它方法（二）牙签少量制备法(一) 小