香蕉基因MaPIF家族全基因组鉴定及激素表达模式

1、应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2021.02036收稿日期 Received: 2021-02-07 接受日期 Accepted: 2021-05-03国家重点研发计划项目（2019YFD1000900）、国家现代农业产业技术体系（香蕉）专项资金（GARS-31-15）和福建农林大学科技创新专项基金项目（CXZX2013119、CXZX2017351）资助 Supported by the National Key Research and Development Program of China (

2、2019YFD1000900), the Special Fund of National Modern Agricultural Industrial Technology System (Banana) (GARS-31-15), and the Science and Technology Innovation Special Fund of Fujian Agriculture and Forestry University (CXZX2013119, CXZX2017351).通讯作者Corresponding author (E-mail: )香蕉基因MaPIF家族全基因组鉴定及激

3、素表达模式吴昊，张城瑜，倪珊珊，罗彬彬，王梦鸽，魏雯敏，陈裕坤，赖钟雄*福建农林大学园艺植物生物工程研究所 福州 350002摘 要 植物光敏色素作用因子（phytochrome interacting factor，PIF）是广泛分布于植物体内的一种转录因子，在植物的生长发育方面有着重要的作用。基于香蕉基因组数据，对香蕉MaPIF基因家族进行基因组鉴定，采用生物信息学分析方法对其进行命名，分析理化性质、蛋白质结构 、基因结构、启动子顺势作用元件以及构建系统进化树；分析PIF家族在不同激素处理下的表达情况。结果显示，香蕉MaPIF家族有7个成员，均含有高度保守的bHLH结构域；编码区长度在1

4、116bp-2 001bp之间，至少包含5个内含子，且大部分位于细胞外；进化树结果可以发现与拟南芥、水稻以及玉米PIF的亲缘关系较近；顺式作用元件预测结果显示，MaPIF上存在多种与激素和光相关的响应元件。qRT-PCR结果显示，MaPIF3-1、MaPIF4、MaPIF4-1在生长素（IAA）、赤霉素（GA）、生长素抑制剂（NPA）处理中均有显著表达，除此之外，所有成员在脱落酸（ABA）处理下均有明显表达。研究结果表明MaPIF在香蕉生长发育中激素调控有重要作用。关键词 香蕉；PIF；基因家族分析；激素；基因表达Genome-wide Identification and Hormone E

5、xpression Pattern of the MaPIF Family of Banana GeneWU Hao, ZhANG Chengyu, NI Shanshan, WEI Wenmin, CHEN Yukun, LAI Zhongxiong*Institute of Horticultural Plant Bioengineering, Fujian Agriculture and Forestry University; Fuzhou 350002, ChinaAbstract Phytochrome-interacting factor (PIF) is a transcrip

6、tion factor widely distributed in plants and plays an important role in the growth and development of plants. Based on banana genome data, in this paper we identified the banana PIF gene family (MaPIF), named it by using bioinformatics analysis methods, analyzed its physical and chemical properties,

7、 protein structure, gene structure, promoter homeopathic elements, and constructed a phylogenetic tree; analyzed The expression of MaPIF family under different hormone treatments. The results showed that the banana MaPIF family had 7 members, all of which contained the highly conserved bHLH and APB

8、domains; the coding regions were between 1116bp and 2001bp in length and contained at least 5 introns, most of which were located outside the cell; in Arabidopsis it is found in rice and corn that it had a close relationship with PIF; the prediction results of cis-acting elements indicated that ther

9、e were many response elements related to hormones and light on MaPIF. The results of qRT-PCR showed that MaPIF3-1, MaPIF4 and MaPIF4-1 were significantly expressed under the treatment of auxin (IAA), gibberellin(GA) and auxin inhibitor (NPA). In addition, all its members were significantly expressed

10、 under ABA treatment. The results of the study indicated that MaPIF played an important role in hormone regulation in banana growth and development.Keywords banana; PIF; gene family analysis; hormone; gene expression在众多的环境信号中，光是最重要的信号之一。是影响植物一系列细胞和生理反应的关键环境因素之一，它几乎影响着植物生命周期的每一个阶段。光不仅是光合能量生产的重要环境线索，也

11、是植物生长发育的重要环境线索，为了应对不同的光环境，不同种类的光感受器可感知不同颜色的光，感知不同的光信号以便做出不同的响应，进化出了不同的光受体1-2。研究表明植物至少有五类3-5光感受器，分别包括感知红光/远红光（600- 750 nm）的光敏色素；隐花色素CRY，CRY2和CRY3)，光促蛋白（PHOT1和PHOT2），以及用于感知蓝色/UV-A光（320- 500 nm），含黄素结合蛋白的F-box（如ZEITLUPE，FKF1/LKP2），这些光感受器负责光调控各种生理过程，如种子萌发、光形态发生向光性、气孔开放和发育、花的转变和昼夜节律等。光敏色素（phytochromes，phy

12、s）是一种可溶性色素蛋白，可感知红（R）光和远红（FR）光6，也是目前研究比较广泛的光受体。在模式植物拟南芥中发现有五种不同的光敏色素，分别称为光敏色素A（phyA）、B（phyB）、C（phyC）、D（phyD）以及E（phyE）7。phyA是光不稳定的，是主要的光感受器，在FR光下介导光形态性反应，而phyB-phye是光稳定的，其中，phyB在介导红光性光形态发生中起主要作用，是最具代表性的特征之一，它以两种不同的光转换形式存在，不活跃的红光吸收形式Pr和活跃的远红光吸收形式Pfr。phyB是主要的光色素调节，在R光下的去黄化反应8-9。光敏色素以非活性Pr形式在细胞质中合成。在黑暗中，

13、phyA和phyB在细胞质中均处于不活跃的Pr状态，而在红光照射下，phyB由Pr转换为Pfr，在远红光的照射下，又由pfr转换成pr的形式存在。PIFs在细胞核中非常丰富，在细胞核中发挥各自的功能促进sko形态发生(黄化)和抑制光形态发生(去黄化)10。在红光照射下，胞质细胞定位的phyA和phyB转化为具有生物活性的Pfr构象，随后转位到细胞核中，与PIFs相互作用，在几分钟内触发PIFs的快速磷酸化、泛素化和降解11。在调控光信号通路的转录因子中，光敏色素相互作用因子（PIFs）的特征很明显。PIFs是基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，属于拟南芥bHLH蛋白家族162个成员中的1

14、5亚群的15个成员，也被称作PILs（phytochrome interacting factor-like）12-14。迄今为止，该亚群的15个成员中有8个已被证明与至少一种光敏色素(phy)相互作用，称为PIFs，其中包括PIF1(也称PIL5，At2g20180)、PIF2(PIL1，At2g46970)、PIF3(At1g09530)、PIF4(At2g43010)、PIF5(PIL6，At3g59060)、PIF6(PIL2，At3g62090)、PIF7(At5g61270)和PIF8(At4g00050)15。研究发现PIFs正调控ABA信号通路在幼苗阶段16-17。特别是在黑暗

15、的情况下，PIFs直接与ABI5启动子中的G-box基序结合18-20；同时加以外源ABA的处理，在黑暗环境下正调控ABI5转录体和蛋白水平21。随着研究的深入，PIFs家族各个成员的功能也逐渐被确定，在功能调节方面不仅有各自的作用，还可以共同参与某个调节。其中PIF4是植物热响应的一个中心转录调节因子22，是植物高温信号的重要组成部分，对植物进行高温处理后，发现GhPIF4基因在棉花花药中高量表达23，且其表达在高温敏感型材料H05中受到高温的显著诱导。PIF4最初被确定为bHLH因子，负调控植物色素B(phyB)信号24，但在进一步研究中发现PIF4和PIF5都能影响下胚轴的伸长13，但U

16、V-B光和UVR8会介导对下胚轴伸长的抑制25，同时PIF4也能够被蓝光抑制活性来抑制热光发生26。PIF3是促进下胚轴生长的关键转录因子27，调控着植物的开花过程28，同时PIF3和PIF1是负调控因子，整合光和昼夜节律控制对叶绿体发育进行调控29。在光敏色素光感受器的光激活下，EIN3结合的F-BOX蛋白(EBFs)1和2介导PIF3蛋白降解，其方式依赖于光诱导的PIF3磷酸化30。PIF1和PCH1、PCHL相互作用来调节不同的光响应的新机制31，PIF1会被RPGE1作用于下游，从而抑制光合基因并调节质体的发育32，同时PIF1和RVE1能够互相作用抑制种子的萌发33。此外PIF1，P

17、IF3，PIF4和PIF5均能作用于光形态的发生34。PIF1和PIF3共同作用能抑制叶绿素的合成以及促进植物顶端下胚轴的负重力作用33-35。PIF4、PIF5和PIF7均能促进植物避阴反应36。除此之外，PIFs和CBFs还形成了复杂的调控网络，在植物中协调冷反应信号6。最近的研究揭示了PIFs在整合多种信号通路方面的新功能，不仅通过其作为转录因子直接靶向基因表达，还通过与多种因子相互作用优化植物生长发育37-39。这些包括内源性(例如，激素)以及非生物(光、昼夜节律和升高的温度)和生物(防御反应)途径13。PIFs与这些通路中的关键因素相互作用，并调整这些通路间的信号整合结果。香蕉是我国

18、比较重要的经济作物，不仅在食用上，在药用研究上也有很大的作用。香蕉生长过程中受相关激素的条件影响较大，PIF又是跟植物生长紧密相关。虽然在很多植物上都进行了PIF的研究，但是目前在香蕉上有关PIF的研究还尚未报道。本实验以已经公布的香蕉基因组的数据为基础，对香蕉PIF基因家族成员进行了鉴定，分析其基因结构、理化性质、蛋白质保守结构域、系统进化树、启动子顺式元件以及用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测在激素处理下，香蕉组培苗各组织和器官的表达模式。为PIF家族成员的功能鉴定及验证提供了充分的数据和研究理论依据。1 材料与方法1.1 材料本实验材料来源于福建农林大学园艺植物生物工程研究所培养

19、的“巴西蕉”（Musa.Cavendish. cv. Baxi，AAA Group）组培苗，选取在12h光/ 12h暗，（25 2）的组培室继代培养40d，长势相近的四叶组培苗。基因组数据来自国际香蕉基因组网站（ HYPERLINK https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/blast https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/blast)。1.2 方法1.2.1 PIF基因家族成员鉴定及蛋白理化特性分析 从香蕉（A基因组）基因库（https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/blast）中

20、下载香蕉PIF家族成员基因的gDNA、蛋白质、CDS序列，利用NCBI（）的Blastn和Blastp以及DANMAN对获得的香蕉PIF家族成员进行鉴定分析。使用CDD（https: /cdd）进行结构域验证，删除不含bHLH的序列，最终获得7个候选基因。采用在线软件Protparam（ExPASy，https: /prot-param）对MaPIF基因家族成员进行氨基酸数量、理论等电点、分子量大小、蛋白质长度、不稳定系数分析；采用Molecular Bioinformatics Center（.tw/）进行亚细胞定位预测；用MEME（http;/tools/meme）对MaPIF成员基因结构

21、进行预测分析；使用在线软件SignalP4.0 Server（http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）进行信号肽预测，利用TBtools软件绘制MaPIF成员内含子、外显子基因结构以及蛋白保守结构域分布图；在香蕉基因组数据库中提取MaPIF各成员起始密码子ATG上游（5端侧翼序列）2000bp的序列作为启动子，利用Plant Care（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/liantcare/html）分析启动子顺势作用元件，对其获得的结果进行绘制整理。1.2.2 MaPIF家族成员系统进化树构建 从

22、Phytozome在线网站（/pz/portal.html）下载拟南芥、水稻的PIF蛋白序列，利用MEGA5对拟南芥、水稻、香蕉进行蛋白多重序列对比，采用NJ法（Neighbor-Joining法，Bootstrap值为1000次，其他参数设置为默认）构建系统进化树。1.2.3 MaPIF编码蛋白保守基序和基因结构分析 利用在线网站GSDS（http：/）分析MaPIF基因结构，使用MEME（/tools/meme）分析MaPIF保守基序（基数参数为10，其余为默认参数），结合结构域分析结果，用TBtools绘制序图进行展示。1.2.4 MaPIF基因家族成员的染色体定位及启动子顺势作用元件预

23、测分析 从香蕉基因组网站（http：/banana-genome-hub.southgreen.fr/）下载获得MaPIF起始密码子上游2000bp的序列用于启动子分析。使用PlantCARE（http:/bionformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）预测启动子区顺式作用元件。在下载获得的A基因组中MaPIF基因家族成员进行染色体定位分析，用TBtools软件进行分析。1.2.5 香蕉MaPIF家族在不同激素处理下的表达分析 上述材料使用生长素抑制剂（NPA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）和生长素（IAA）对其进行处理，激素浓度为10

24、0mol/L，将材料放置于相对湿度为70%-80%、温度为28，光照强度为2000lx，光周期为12h光/ 12h暗的培养箱中进行处理，分别于1h、4h、8h后以及对照组取组培苗第二片真片用液氮冻存收样，保存于-80冰箱中保存，用于后续提取RNA。使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）分别提取不同激素处理样品各个部位的RNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测提取的RNA浓度、纯度和完整性是否合格用于cDNA合成。采用 Fermentas 公司 RervertAidTM First-Strand Synthesis Kit 的试剂盒进行3-RACE

25、 和开放阅读框（ORF）的cDNA第一链合成。采用PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）(Takara)试剂盒反转录不同处理样品的RNA获得cDNA用于qRT-PCR。表1 MaPIF定量引物序列引物名称Primer name引物序列（5-3）Primer sequenceMaPIF1F: TGTGGAGCTAAGGAGAAGGT R: CACACACACACACAGAGACAMaPIF4 -1F: GAGAGAGAGGGAGAGAGGGG R: TCAAGTGTTCGTTGGGCAAAMaPIF1-1 F: ATGTCGTCATGCATAG

26、CC R:GCATTAGACACAGTGAAAACTGAMaPIF4F: GGGAACAAGAGACACAGAGAGA R:GGAAAGTTGAAAGAGAAGGGAGGMaPIF3F: CCATCACGCCTCTCCTTTTC R: ACAAGCATAGCAGTGGTAGGAMaPIF5F: ATGGCGGGCATCGGTGT R: CTCCATGACTCACTTCATTCATTCTAATAGMaPIF3-1F: CGATCGTGGCCATTGGATG R: AACGTCGGATCCTAAGCCTCTable 1 MaPIF quantitative primer sequence注：退火温

27、度均为60，延伸15sNote: The annealing temperature is 60，extension time is 15s2 结果与统计2.1 香蕉MaPIF家族成员鉴定在香蕉基因网站（A基因组https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/blast）获得13条PIF相关基因，拟南芥相关研究中已经表明PIF包含一个稳定的bHLH结构域。在NCBI网站进行保守结构分析，和拟南芥中PIF相关基因对比筛选出7条包含bHLH结构域的候选基因，通过参考拟南芥、水稻的基因命名方式对其7个MaPIF成员进行系统命名（表2），分析基因的序列特征。表2 香蕉基因

28、组MaPIF全基因组家族鉴定Table 2 Gene-wide identification of MaPIF genes in the banana基因IDGene ID注释Annotated染色体Chr基因组位置 Genomic position起始Start 终止EndcDNA长度/bpcDNA length命名NameMa01_p12260.1MaPIF3Chr1888412988867522001PIF3Ma05_p02230.1MaPIF4Chr5141836414205901608PIF4-1Ma01_p10120.1MaPIF1Chr1725376372571411053PIF

29、1Ma04_p38300.1MaPIF4Chr435891079358934201629PIF4Ma06_p31780.1MaPIF5Chr632817903328212701116PIF5Ma06_p33060.1MaPIF1Chr633839405338413461248PIF1-1Ma05_p20730.3MaPIF3Chr532390873323932171821PIF3-1对候选的MaPIF家族成员基因的CDS进行序列比对分析，长度在1 053-2 001bp内，大部分长度集中在1800bp左右。序列长度较短的成员有3个，分别是基因组中MaPIF1的CDS（1053bp）、MaPIF

30、5的CDS（1116bp）、MaPIF1-1的CDS（1248bp）。MaPIF基因组家族成员的CDS序列中MaPIF4和MaPIF4-1长度差异性小，相似度极高。2.2 MaPIF家族成员氨基酸理化性质分析对香蕉MaPIF家族基因组的蛋白质特性进行分析（表3），发现大部分氨基酸数目（Amino acid number）集中在535-606 之间，但有几个比较特殊，如：MaPIF3的氨基酸数高达1241个，但是MaPIF5、MaPIF1的氨基酸数分别只有371个、415个；等电点（pI）介于5.53 8.28；蛋白分子量（Molecular weight）在41.02kD-134.26kD；所

31、有MaPIF家族成员均为不稳定性蛋白，且均为亲水性蛋白；信号肽预测分析发现，成员均不含有信号肽。亚细胞定位预测分析发现，MaPIF家族成员大多数定位在细胞外、过氧化酶体上。表3 香蕉基因组MaPIF家族中蛋白特性分析Table 3 Protein haracteristics analysis of MaPIF genes in the banana基因名称Gene name氨基酸数Amino acidnumber等电点pI分子量Molecularweight/KD不稳定系数Instabilityindex亲水性Gravy亚细胞定位Subcellular Localization信号肽Sign

32、al peptidePIF312416.13134.2655.74-0.550过氧化酶体 PeroxisomeNoPIF4-15356.1558.8059.97-0.690细胞外 ExtracellularNoPIF3-15356.1558.8059.97-0.690细胞外 ExtracellularNoPIF16065.5364.7062.52-0.506过氧化酶体 PeroxisomeNoPIF45425.9158.6659.20-0.720细胞外 ExtracellularNoPIF53718.2841.0269.99-0.603过氧化酶体、细胞外、线粒体外膜Peroxisome, Ex

33、tracellular, OuterMembraneNoPIF1-14156.1045.6164.41-0.492细胞外、过氧化酶体Extracellular, PeroxisomeNo2.3 香蕉MaPIF家族成员系统进化树构建为进一步了解MaPIF家族成员的功能，使用Phytozome在线网站下载拟南芥、水稻的PIF氨基酸序列，结合香蕉基因组鉴定的7个MaPIF成员的氨基酸序列，采用MEGA对拟南芥、水稻、玉米、香蕉、的氨基酸序列进行系统进化树构建分析，分析其聚类特征，探索PIF在不同物种之间以及MaPIF家族成员内部的进化亲缘关系。进化树结果显示（图1），香蕉MaPIF家族成员可分为3个

34、亚家族（Class I、II、），其中MaPIF1和MaPIF5属于Class I；MaPIF1-1、MaPIF4、MaPIF4-1属于Class II；MaPIF3和MaPIF3-1属于Class 。根据不同的Class我们可以看出他们在进化关系上有所不同，导致其功能也有所差异。MaPIF家族与水稻、拟南芥PIF亲缘关系都比较近，说明可能存在相似的生物学功能，有助于后续我们了解MaPIF在香蕉生长发育进程中的作用。其中MaPIF3和和玉米中表达比较明显的ZmPIF1和ZmPIF3同源性较高，推测在植物各种信号通路功能中有重要的作用。在拟南芥中，AtPIF7能够直接参与生长素的调节，进化分析发

35、现MaPIF1、MaPIF5和AtPIF7的同源性较高，推测其也具备此功能。本文中几个物种的PIF基因在进化树中的分布比较广泛，说明PIF家族在植物中进化复杂。图1 水稻（Os）、拟南芥（At）、玉米（Zm）香蕉（Ma）基因组的25条PIF家族成员氨基酸序列系统进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of 25 PIF family members of rice (Os) ，Zea mays（Zm）Arabidopsis thaliana (At) ，and Musa accuminata (Ma) genomes2.

36、4 MaPIF家族成员基因结构及蛋白质保守结构和保守基序分析通过使用TBtools软件分析香蕉A基因组中7条MaPIF基因中内含子、外显子个数以及分布情况（图2）以及蛋白质保守结构域，发现所有成员均含有1-2个外显子、内含子和UTR区。MaPIF所有成员大部分含有6个内含子。对比其他人对拟南芥、玉米等大多数成员的内含子数以5个为主的研究结果不同。同时我们能发现，在一些进化关系比较近的成员之间内含子数量也不同，比如MaPIF4有6个内含子，而同亚族其他成员（MaPIF1-1、MaPIF4-1）均含有5个内含子。同时编码区长度也有明显差异，最长的为2 001bp，最短的为1 608bp。图2 Ma

37、PIF家族基因结构分布图Fig. 2 Gene structural distribution map of MaPIF fmaily用MEME在线软件分析MaPIF家族成员保守基序，同时结合TBtools软件对结果进行修饰，在使用MEME时设置参数为10。结果如图（图3）所示，所有成员蛋白序列中均含有高度保守的motif1和motif2。对比发现，motif1是bHLH保守结构域，MaPIF所有家族成员均包含这个结构域，说明这7个MaPIF是bHLH类转录因子家族中的PIF转录因子。此外，MaPIF各成员至少包含3个motif；且MaPIF家族成员均含有motif4；除MaPIF1之外，其余

38、各成员都含有motif3以及motif9，motif5和motif10都只在三个成员中出现。同时发现，分布在同一亚家族的成员的MaPIF1-1、MaPIF4、MaPIF4-1都有着相同的motif数量和类型，而不同族的成员之间motif数量、种类差异较大，比如在进化分析中MaPIF1和MaPIF5同属于一个Class，亲缘关系和其他成员较远，在保守基序的分析中发现也跟其他成员在motif数量上也有较大差异，且不含motif2。说明保守基序也是影响亲缘关系的重要因素，也导致了家族成员各自功能的差异性。此外，MaPIF3中含有代表APA结构域的motif2，同时与拟南芥PIF3以及水稻中PIL15

39、、PIL16同属于一个Class，和前人研究结果一致。 图3 MaPIF家族蛋白motif分布图Fig.3 Protein motif distribution map of MaPIF amily2.5 MaPIF基因家族成员染色体定位及启动子顺势作用元件预测分析如图4所示，MaPIF在香蕉上分布呈现不均匀分布在1号、4号、5号、6号染色体上，其中1号、5号、6号均有两个成分布员，在4号上只有MaPIF4。同时，结合进化分析我们可以发现同一Class的成员分布也都各部相同，进一步解释不同成员会有各自独特功能的原因。图4 MaPIF基因家族染色体定位分布Figure.4 Chromosomal

40、 location distribution of MaPIF gene family采用在线软件Plant CARE 对MaPIF中筛选确定的7个成员启动子进行顺式作用元件预测分析，如图（图4）。预测结果显示，在成员基因上游2000bp的启动子序列中含有大量能让基因正常完成转录过程的核心元件（TATA-box、CAAT-box），MaPIF家族成员启动子序列中也含有大量与激素和生长（如光、植物激素、胁迫、生理生长、MYB转录因子结合位点等）有关的作用元件，但是各基因成员所含顺式元件数量和类型也有所差异。其中MaPIF1含有14种作用元件，所含种类最多。同时发现，除MaPIF1-1之外，其他成

41、员在启动子区域中都存在与植物激素相关的元件，含有生长素（TGA-element、TGA-box）响应元件的有MaPIF1和MaPIF3，含有赤霉素（P-box、GARE-motif、TATC-box）和脱落酸（ABRE）响应元件的有MaPIF1、MaPIF3、MaPIF3-3、MaPIF4、MaPIF4-1和MaPIF5，含茉莉酸甲酯（TGACG-motif、CGTCA-motif）响应元件的有MaPIF1、MaPIF3、MaPIF4、MaPIF4-1，含有水杨酸（TCA-element）响应元件的有MaPIF3-1、MaPIF4-1、MaPIF5。通过对各成员的分析统计，发现各成员的响应元件

42、数量相差较大，说明其在植物激素应答中的功能可能各不相同。不同的胁迫相关元件也在植物的生长发育过程中有着各自分工，该家族成员中均含有厌氧胁迫响应元件ARE和光响应元件，5个成员含有防御响应（TC-rich repeats）元件，4个成员含有干旱诱导MYB结合位点（MYB-Drought），4个成员含有参与光响应MYB结合位点，3个成员含有MYBHv1结合位点，只有MaPIF1含有缺氧特异性诱导（GC-motif）响应元件。此外，在该家族成员启动子区域还发现与生长发育相关的顺势作用元件，如生理周期（Circadian）、胚乳表达（GCN4_motif）、分生组织表达（CAT-box）、富AT的DN

43、A蛋白结合位点、玉米蛋白代谢（O2-site）。这些表明MaPIF家族成员在香蕉的生长发育过程中参与重要调控。图5 MaPIF基因家族启动子顺式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting clements of MaPIF gene family promoter2.6 香蕉MaPIF家族在不同组织特异性表达分析为了探究香蕉中MaPIF家族基因成员的组织特异性表达，本文章结合香蕉不同组织（根、茎、叶）采用qRT-PCR方法分析其表达模式，结果（图5）表明：MaPIF1-1、MaPIF3-1、MaPIF4、MaPIF4-1在根中有表达量，但表达量一般；各成员在茎中几乎都

44、没有表达；MaPIF1、MaPIF1-1、MaPIF3、MaPIF3-1在叶中有高表达量，MaPIF4、MaPIF4-1表达量一般，MaPIF5在叶中基本没有表达。香蕉MaPIF家族基因在各组织表达有明显差异，说明不同成员在香蕉的生长发育过程中可能起着不同的作用。 Root Stem Leaf 图6 香蕉MaPIF基因不同组织表达模式. Root、Stem、Leaf 分别代表根、茎、叶.Fig .6 Expression pattern of banana MaPIF gene tissue. Root, Stem and Leaf represent roots, stems and lea

45、ves, respectively.2.7 香蕉MaPIF家族在不同激素处理下的qRT-PCR表达分析为了探究香蕉PIF基因在激素胁迫下的响应机制，结合MaPIF启动子顺式作用元件分析结果，利用qRT-PCR方法检测其在激素处理下的表达模式。用浓度均为100umol/L的赤霉素（GA）、生长素（IAA）、生长素抑制剂（NPA）、脱落酸（ABA）处理分别处理1h、4h、8h。观察香蕉PIF基因家族各成员间的表达趋势。结果如（图5），与对照相比，总体来看香蕉PIF家族在不同激素梯度处理中，都为上升趋势，然后趋于平稳或下降。其中MaPIF3-1、MaPIF4、MaPIF4-1以及MaPIF5整体表达

46、较丰富。在GA处理下，MaPIF1和MaPIF3-1较早响应，且均在4h处理条件下表达量最大；在ABA处理中所有基因均有表达，且各成员之间表达趋势一致；在NPA处理下，各成员表达量较小或不表达，说明MaPIF家族成员对NPA响应不明显；IAA处理下，各基因成员均在8h表达最明显。同时发现，在分别进行IAA和NPA的处理下，PIF家族成员都有明显得差异，NPA在MaPIF1、MaPIF1-1、MaPIF3中基本不表达，说明NPA明显抑制该基因在植物中的表达，IAA则在一定程度上促进了基因的表达，与之形成拮抗作用。通过以上分析可以看出，MaPIF表达量和激素诱导关系密切，推断和启动子中大量激素响应

47、相关的顺势元件有关。 图7 MaPIF1、MaPIF1-1、MaPIF3、MaPIF3-1、MaPIF4、MaPIF4、MaPIF5在不同激素处理下的表达水平；不同小写字母表示处理间差异显著（P 0.05）Fig. 7 The expression levels of MaPIF1, MaPIF1-1, MaPIF3, MaPIF3-1, MaPIF4, MaPIF4, MaPIF5 under different hormone treatments; different lowercase letters indicate significant differences between t

48、reatments (P 0.05)3 讨论3.1 植物PIF家族进化特性在拟南芥中，bHLH转录因子光敏色素相互作用因子PIFs直接诱导生长相关基因的表达，从而增强了短天节律性下胚轴伸长(hypocotyl short days，SD)11-14。PIFs被认为是光敏色素感知的光信号传导的中心角色，然而，进一步的研究表明PIFs还参与了许多其他信号通路，如热诱导反应、生物钟或激素信号、发育和糖源信号，以及对生物和非生物压力的反应。研究表明，所有PIF蛋白均含有一个保守的n端序列，名为活性植物色素b结合(active phytochrome B-binding，APB)基序，这是与phyB活性

49、形式结合的必要和充分条件，同时，PIF1和PIF3还包含一个单独的结构域，称为活性光敏色素a结合基序（active phytochrome A-binding，APA），这是与活性phyA相互作用所必需的15-16。光敏色素互作因子(PIFs)作为一个胞内信号调控的重要组分，PIFs广泛参与到由多种植物内源激素如赤霉素、乙烯、生长素、油菜素内酯、脱落酸和外部环境因素如高温、光等所介导的信号网络中38。PIFs是红光下光形态建成的调控因子，既能与光敏色素相结合，又能与植物赤霉素信号传导途径中的关键基因相互作用12。PIF广泛存在植物体内，调控植物的多方面生理功能，比如高温调节35、下胚轴伸长36

50、、果实重量37、种子萌发38等，和植物的生长关系密切。目前，研究人员在很多植物中对PIFs都有广泛的研究，在最新的研究中发现拟南芥（Arabidopsis thaliana）有8个成员18、水稻（Oryza sativa）有6个成员19、杨树（Populus）有10个成员20、玉米（Zea mays）有6个成员21。在这些植物上均被克隆验证，研究发现PIF家族不仅在N端具有高度保守的bHLH和APB结构域，部分一年生草本以及禾本科植物中还存在一个APA保守结构域，在MaPIF中MaPIF3发现此结构域，也说明MaPIF3在进化功能上更为丰富。从进化树的结果来看，MaPIF被大致分为4个亚家族，

51、其中MaPIF3、MaPIF3-1与拟南芥的PIF3在同一族，其中拟南芥PIF3有比较丰富的功能（比如：促进下胚轴伸长、调节开花等），这对于人们后续在香蕉上生长发育的研究有较大的帮助；MaPIF4、MaPIF4-1和玉米的PIF4在同一族，相关研究表明，玉米PIF4对于温度变化反馈和生长素调节方面有着重要的作用，且保守结构域、氨基酸数量、蛋白结构等理化性质也相似，所以推测其在功能方面也相似，需要进一步探究验证。整体来看，MaPIF的分布和拟南芥的PIF分布大致相同，有相似的亲缘关系，对于后面在香蕉上的研究有一定的指导作用。3.2 香蕉MaPIF家族成员具有多样性PIF广泛存在于植物中，和植物的

52、生长发育关系密切。前人研究发现，PIF促进植物的光形态建成，促进下胚轴生长、子叶张开角度等。在拟南芥的研究中发现AtPIF3在红光下叶面积增加，下胚轴变短，对拟南芥光形态建成的抑制能力最强39。进化树的结果发现，MaPIF3、MaPIF3-1和AtPIF3同属于一个分支，有较高同源性；同时MaPIF3、MaPIF3-1在香蕉叶片中表达量明显，说明其重要参与叶片的生长发育过程。但是我们也发现在香蕉叶片中MaPIF1、MaPIF1-1同样有比较明显表达量；MaPIF4、MaPIF4-1在香蕉叶片中表达量较低，这与在拟南芥上的研究不太一样，说明PIF在不同植物中的表达模式也不太一样，有比较丰富的表达

53、模式，推测在植物的组织器官发育中有重要调控作用。PIF家族成员的定量表达分析中发现各成员的表达不同，在不同组织表达量也不同。实验证明，玉米21中bHLH12、bHLH74、bHLH180基因叶表达量最高，杨树中20PIF1、PIF8a、PIF9b在叶片中表达量最高；在陆地棉中，组织表达分析表明PIF主要在茎、叶、柱头或胚珠中优势表达，同时发现，GhPIF4在花药发育后期表达量最高。我们也验证了在香蕉中PIF3-1、PIF4、PIF4-1在叶的表达量最高。在对香蕉PIF的启动子顺式元件分析中也发现有分生组织表达（CAT-box）、缺氧特异性诱导，说明MaPIF可能也参与香蕉生长组织的发育过程。3

54、.3 香蕉MaPIF可能参与激素元件应答探究MaPIF启动子序列结构，元件特征能更好地了解香蕉生长发育以及非生物胁迫应答机制。研究表明，PIF能直接与DELLA相关蛋白作用，从而抑制PIF的光响应以及赤霉素的信号传导40-41；PIF也参与脱落酸的信号传导途径42，在拟南芥的研究中发现，PIF1能够与相关蛋白启动子结合，激活RGAI和GAI的表达从而在黑暗中抑制种子的萌发43。水稻中发现，TaPIF4基因在外源ABA处理下表达被明显抑制44；香蕉中MaPIF家族均不同程度响应脱落酸处理，其中MaPIF1、MaPIF1-1、MaPIF3、MaPIF4、MaPIF4-1响应较为显著；且MaPIF3

55、-1、MaPIF4、MaPIF4-1对赤霉素（GA）、生长素（IAA）、生长素抑制剂（NPA）、脱落酸（ABA）都显著响应。通过启动子序列分析发现大部分成员都含有生长素、脱落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯等激素响应元件。表明可能MaPIF参与植物多中激素响应途径。本研究在香蕉基因组的基础上对其进行家族鉴定分析。探究各成员的理化性质、进化关系、启动子顺势元件、蛋白质保守结构等。发现其在不同组织器官中的表达及不同激素处理下的表达模式。预测其参与香蕉叶片不同生长发育过程（如激素诱导、胚生长、种子发育、光反应等），能够通过控制基因的表达从而控制一系列香蕉在应对生物胁迫和非生物胁迫的反应，在对于香蕉实际生产可以

56、给到一定的启发和帮助。结果表明，香蕉MaPIF在进化过程中具有高度保守性，主要参与香蕉的叶生长发育调控机制，以及激素诱导。但是对于香蕉中PIF的研究目前还没有一个完善系统的结果，其他物种上的研究也没有深入，在应对实际情况会有很多未知性。同时，PIF基因也会受其他基因调控的影响，所以进一步需要研究与PIF相关的一个整体反应通路，比如在番茄45中低温能够促进HY5的丰富，抑制PHYB的表达，从而促进ABA积累，诱导CBF1及靶基因的表达，最终提高抗寒性。通过联系前后相关联基因对于PIF的影响，能够更明确分析PIF对于植物的生长的调控。本文对于MaPIF的成员功能验证以及后面在香蕉的生长研究能提供一

57、定的基础。参考文献 ReferencesXu DQ. Multifaceted Roles of PIF4 in Plants J. Trend Plant Sci, 2018, 23 (9): 749-751项蕾蕾, 李丹, 孙雪丽, 田娜, 刘范, 付帅, 陈裕坤, 林玉玲, 程春振, 王天池, 赖钟雄. LED补光对香蕉组培苗增殖和生理生化指标的影响J. 应用与环境生物学报, 2020, 26 (03): 590-596 Xiang LL, Li D, Sun XL, Tian N, Liu F, Fu S, Chen YK, Lin YL, Chen CZ, Wang TC, Lai

58、ZX. Effect of LED Supplementary Light on Proliferation and Physiological and Biochemical Indexes of Banana Tissue Culture Seedlings J. Chin J Appl Environ Biol, 2020, 26 (03): 590-596David JS, Chiara Me, Sven r OK, Beatrix E, Ling Z, Philipp J, Frank S, York DS, Enamul H, Andreas H. Light-activated

59、phytochrome A and B interact with members of the SPA family to promote photomorphogenesis in Arabidopsis by reorganizing the COP1/SPA complex.J. Plant Cell, 2015, 27 (1): 189-201Xue DL, Chuan MZ, Peng BX, Qian L, Hong LL, Hong QY. Red-Light-Dependent Interaction of phyB with SPA1 Promotes COP1SPA1 D

60、issociation and Photomorphogenic Development in Arabidopsis J. Mol Plant, 2015, 8 (3): 467-78Inyup P, Enamul H. Plant photoreceptors: Multi-functional sensory proteins and their signaling networks J. Semin Cell DevBiol, 2019, 92: 114-21Jiang BC, Shi YT, Peng Y, Jia YX, Yan Y, Dong XJ, Li H, Dong J,