具体意见说明

1、具体意见说明1、英文摘要与中文摘要不符，请修改；2、“2.1正交实验设计”部分放在含量测定项后；如何体现出半仿生法？在正交实验设计因素水平选择中表述的不够明确和突出。3、丹参酮A和丹酚酸B的含量测定测定方法均为药典方法，不需要进行方法学实验，这一部分可以大大简化，只需引用就可以了。4、文中表1采用标准三线表,表中的数据不清楚，如-0.4045代表什么？5、图1和图2可以删去；6、正交实验结果分析除了直观分析外，还应该对数据进行进一步的统计分析。而且优化后的工艺参数并不能直接感受到是半仿生提取工艺。7、讨论中重点阐明优化的工艺与传统工艺的不同点，尤其是与参考文献2的异同、区别点。本文的创新之处在

2、哪？否则本文就推动了其意义。修改意见说明尊敬的编辑老师：您好！遵循您的修改意见，稿件20100729001的修改回复如下：1、中英文摘要不相符的部分已作了修改；2、文中内容需要调整部分已作了调整；由于我们前期已做了半仿生提取法与其它方法的比较研究，证实半仿生提取法优于其它提取方法，并已作了半仿生提取方法条件的优选，所以本次实验中延用以前的结果，在文中已作了补充介绍；3、含量测定方法中可以简化的部分已作了相应简化；4、表中如-0.4045的数据代表标准化后的数据，是为消除各指标单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响而作的处理，文中相应的地方已作了说明；5、可以删除的图已删除；6

3、、正交试验结果已补充了相应的统计分析；因本文是以半仿生法为基础考察集成提取的效果，考察其它的参数，所以优化的结果可作为半仿生提取工艺；7、讨论部分已补充了对本文的创新之处：传统的以水为溶剂进行半仿生提取，改为以一定浓度的乙醇为溶剂量同时提取水溶性和脂溶性成分，与文献中的集成提取方法相比加入了半仿生提取法。以上均在您的指导下认真更正。若有其他未说明之出，万望以您方便的方式及时联系我们。因我们水平有限而给您与贵刊带来的不便之处，谨致以诚挚的歉意!敬祝：工作愉快，生活美满幸福！作者 杨光义2010年8月26日正交实验设计优选丹参半仿生集成提取工艺杨光义，叶方，雷震，王刚，郝新才（湖北医药学院附属太和

4、医院，湖北，十堰，442000）摘要 目的：优选丹参中水溶性和脂溶性成份半仿生集成提取的最佳工艺条件。方法：以丹参酮A、丹酚酸B含量、总酚酸得率、干浸膏收率为指标，采用L9(34)正交表进行正交试验，优选半仿生-乙醇集成提取丹参有效成分最佳条件。结果：提取溶剂为不同pH值的70乙醇(pH值分别为2.0、7.5、8.3)，料液比1：18，提取时间1.5h，综合评价指标最优。结论：所得半仿生-70%乙醇集成提取丹参有效成分工艺科学、合理。关键词 正交实验设计；丹参；半仿生；提取工艺Study on optimum Semi-bionic integration technique extracti

5、on for in Salvia miltiorrhiza Bge. by orthogonal testYANG Guang-yi，YE Fang,LEI Zheng,Wang gang,HAO Xin-cai (Taihe Hospital Affiliated with Hubei Medical University,Shiyan,Hubei, 442000)Abstract Object: To optimize the best semi-bionic extraction condition of liposoluble and water-solubility in Salvi

6、a miltiorrhiza Bge. Methods: By making the extaction ratios of tanshinoneA, salvianolic acid-B, total phenolic acid and dried extract weight as the indexes to optimize the semi-bionic extraction condition. The experiment were designed by a orthogonal experiment. Results： Optimum extraction condition

7、 were: alcohol 70%, time 2h, stock ratio 1:18 (gmL-1,mass:volume). Conclusion：The extraction method of Semi-bionic-70% ethanol extraction is scientific and rational. Key words: Orthogonal test; Salvia miltiorrhiza Bge.; Semi-bionic; Extraction method丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。有祛瘀止痛、活血

8、通经之功效。丹参的主要有效成分包括脂溶性的二萜醌类及水溶性的酚酸类成分。中华人民共和国药典2010年版以丹参酮A和丹酚酸B为指标，对丹参药材进行质量控制1。为了能同时提取丹参脂溶性成分和水溶性成分,本实验在半仿生条件下，采用正交设计法，以丹参酮A、丹酚酸B含量、总酚酸得率、干浸膏收率为指标，对丹参有效成分集成提取工艺进行优选，为后续研究奠定基础。1仪器与材料戴安UltiMateTM3000型（美国戴安公司）高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器和Chromeleon软件数据处理系统；紫外分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司）；电子天平（型号AUW12

9、0D，岛津公司）；CQX25-06型超声波震荡器(上海必能信超声有限公司)；离心机（TDL-5A，菲恰尔公司）。丹参酮A对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110766-200518）；丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111562-200807）；绿原酸对照品（中国生物物品检定所，批号：110753-200413）；丹参药材采于湖北神农本草中药饮片有限公司房陵丹参基地，由湖北医药学院药学系生药学教研室主任陈吉炎教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，样品打粉，过3号筛备用。甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水。其他试剂均为分析纯。2实验

10、方法与结果2.1丹参酮A的含量测定12.1.1色谱条件 DiamonsilTM（钻石）18柱（5m,250mm4.6mm），前加预柱(104.6mm)；检测波长：270nm；柱温：30；流动相：甲醇-水(75:25)，流速:1.0mLmin-1；进样量：5L。2.1.2对照品溶液的制备 精密称取丹参酮A对照品适量，加甲醇制成16g.mL-1的丹参酮A对照品溶液，以0.45m滤膜滤过备用。2.1.3样品液的制备 按表1各实验条件，称取丹参药材6g，浸泡30 min，回流提取3次(每次提取时间按总提取时间2：1：1分配)，提取液用4层纱布加100目筛分别滤过， 3000 r.min-1离心25 m

11、in，合并上清液并浓缩定容至100mL，制得19号样品液(每lmL相当于原饮片0.06g)。2.1.4供试品溶液的制备 精密量取样品液5mL置蒸发皿中蒸干，移置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50mL密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40Hz)30 min，放冷，加75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试液A1A9(每1 mL相当于原饮片0.006 g)。2.1.5丹参酮A的含量 取A1A9号供试品溶液及对照品溶液，分别进样5L，记录丹参酮A色谱峰面积，以外标一点法计算含量，结果见表1。2.2丹酚酸B含量测定1 2.2.1色谱条件 DiamonsilTM（钻石）

12、18柱（5m，250mm4.6mm），前加预柱(104.6mm)；检测波长：286nm；柱温：30；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)，流速:1.0mLmin-1；进样量：10L。2.2.2对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成140g.mL-1的丹酚酸B溶液，以0.45m滤膜滤过，作为对照品溶液备用。2.2.3供试品溶液的制备 同“2.3.3”项下供试品溶液。2.2.4丹酚酸B含量的测定 取A1A9号供试品溶液及对照品溶液，分别进样10L，记录丹酚酸B色谱峰面积，以外标一点法计算含量，结果见表1 。2.3比色法测样品中总酚酸含量32,432.3.1对

13、照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品20.0mg用75%甲醇定容至50mL容量瓶中得0.4mgmL-1对照品溶液。2.3.2供试液的制备 精密量取“2.3.3”项下溶液5mL，加75%甲醇定容至10 mL即得供试液。2.3.3测定波长的选择 分别精密吸取绿原酸对照品及供试品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入0.5%亚硝酸钠溶液5.0mL，混匀后加入10%硝酸铝溶液0. 5 mL，混匀，再加入1moLL-1氢氧化钠溶液5. 0 mL，以75%甲醇稀释至刻度，摇匀，随行试剂空白，反应10 min后，在300900 nm波长范围扫描，测定其吸收曲线。结果表明，对照品和供试品吸收光谱基本一致，在5

14、19 nm处有最大吸收波长，故选择测定波长为519 nm。2.3.4线性关系考察 精密量取0.4mg.mL-1的对照品溶液0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分别置10mL量瓶中，加75%甲醇定容。分别各取2 mL置于25mL容量瓶中，按“2.5.3”中络合显色剂的加入法显色后分别于519nm波长处测吸光度。以对照品含量C(g.mL-1)为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，求得其回归方程为A = 3.07C+0.0295，R=0.9995。结果表明，绿原酸在0.080.40mg.mL-1范围内呈良好的线性关系。2.3.5精密度试验 取上述对照品溶液，以溶剂为空白，于519

15、 nm处测定吸光度，重复6次， RSD为0.15。结果表明，仪器精密度良好。2.3.6稳定性考察 取同一供试品溶液分别于0，1，2，4，6h测定吸光度，RSD为0.58。说明供试液在6h内稳定性良好。2.3.7重复性试验 按供试品测定方法操作，对同一样品重复测定6次，平均含量70.02mg.g-1 ，RSD为0.79。2.3.8加样回收实验 精密称取已测含量的药材，以加入法进行实验，结果平均回收率为95.47% , RSD为1.56%，表明本方法回收率良好。2.3.9样品中总酚酸的含量测定 取各供试品溶液及对照品溶液，按“2.5.3”中络合显色剂的加入法显色后分别于519nm波长处测吸光度A值

16、，计算其含量，结果见表1。2.4干浸膏得率的测定 精密量取19号样品溶液各25 mL置已烘干恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105烘3h，置干燥器内30 min后称重并计算干浸膏得率，结果见表1。2.5正交实验设计 为保证实验的可比性和可重复性，以半仿生提取法（三次提取溶剂的pH值分别为2.0、7.5、8.3）为基础，在药材规格、提取温度、滤过、浓缩等条件相同的前提下，选择乙醇浓度、提取时间和溶媒用量3个因素，每个因素各取3个水平：乙醇浓度（60%、70%、80%），提取时间（1.5、2.0、2.5 h），料液比（1:14，1:18，1:22 g.mL-1）进行L9(34)正交设计2，确定各因素不

17、同水平对丹参有效成分提取量的影响，安排布点实验，结果见表1。试验号乙醇浓度（%）总提取时间（h）料液比g.mL-1空白丹参酮IIA(%)（标准化值）丹酚酸B(%)（标准化值）总酚酸(%)（标准化值）干浸膏(%)（标准化值）综合评价值Y1601.51:1410.0636（-0.4045）3.0458（1.4979）7.6700（1.4792）40.0333（1.4808）9.19862702.01:1420.0615（-0.8588）2.8760（0.1457）7.2740（0.6553）38.0400（0.6132）0.43983802.51:1430.0620（-0.7644）2.6673（

18、-1.5161）6.2527（-1.4694）36.8933（0.1141）-11.13564802.01:1810.0659（0.1029）2.8859（0.2242）7.2844（0.6770）38.0667（0.6248）3.63715602.51:1820.0633（-0.4639）2.8072（-0.4020）7.1281（0.3518）37.1933（0.2447）-1.29766701.51:1830.0747（2.0659）2.9907（1.0586）6.9509（-0.0168）33.7667（-1.2467）8.07647702.51:2210.0705（1.1258）2.

19、9399（-0.6547）6.9822（0.0483）34.9133（-0.7476）0.81068801.51:2220.0616（-0.8538）2.8012（-0.4495）6.9093（-0.1035）37.8333（0.5233）-3.69719602.01:2230.0661（0.1499）2.7052（-1.2143）6.1798（-1.6212）32.9400（-1.6065）-9.6633K1-1.762313.5779-1.497213.6463K29.3268-5.586410.4159-4.5549K3-11.1956-11.6226-12.5499-12.7225R2

20、0.522425.200522.965826.3688表1 L9(34)实验设计表注：三次提取时间比为2：1：1；表格中括号中数字为标准化后的值。2.6试验结果 以丹参酮A、丹酚酸B、总酚酸得率和干浸膏收率作为考察指标。为消除各指标单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响，将各指标数据按公式Xij=（Xij-j）/Sj进行标准化处理（式中Xij为标准化的值，Xij为样品液i中成分j的含量，j为各种样品液i中成分j的平均值，Sj为成分的标准偏差），再根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，标准化后的值加权后求和即得综合评价Y值（Y=（丹参酮A+丹酚酸B）/26+总酚酸3

21、+干浸膏得率1），根据Y值确定丹参提取方法的影响因素，这样更科学合理，结果见表1。由极差R可知，提取时间对丹参水溶性成分及脂溶性成分提取的影响最大，各因素影响大小次序为B C A，直观分析结合实际得出最佳的提取工艺条件是A2B1C2，即乙醇浓度为70%，提取时间1.5h，料液比1：18。表2方差分析结果方差来源自由度离差平方和均方F值P值乙醇浓度270.34735.1732.3130.05料液比287.94543.9722.892 C A。从表2方差分析看出，提取时间对丹参有效成分的提取有统计学意义（P0.05）。结合实际得出最佳的提取工艺条件是A2B1C2，即乙醇浓度为70%，提取时间1.5

22、h，料液比1：18。2.7优化条件的验证 按照优化的工艺条件，做3份验证性试验，依“2.32.6”项下方法进行测定，结果测得丹参酮A 、丹酚酸B、总酚酸含量分别为0.7620、29.7471、69.3124 mgg-1，干浸膏得率为0.3908 mgg-1。结果与正交试验法优选结果基本一致，说明半仿生集成提取丹参有效成分优选工艺合理，具有可行性。3讨论3.1半仿生提取法(简称SBE法)是在常压、相对温度较高的条件下，以不同pH值的水为溶剂进行连续提取得到含指标成份较高 “活性混合物”的一种新提取方法54；丹参主要有效成分包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类。本实验在半仿生提取法基础上改用一定

23、浓度的、不同pH值乙醇溶液同时提取这两种成分25，并采用正交实验优选提取工艺。实验结果表明，采用优选后的提取工艺对丹参有效成分的综合提取率效果较好，操作简便，可以作为丹参或以丹参为主要成分的中药制剂以及中药免煎剂的有效成分提取方法。3.2丹参水溶性成分酚酸类化合物具有邻酚二羟基结构，可以与亚硝酸钠-硝酸铝络合显色，生成的络合物在可见光区有特征吸收，其吸收度与总酚酸含量成正比，且形成的络合物稳定，数小时内测定的吸收度无明显变化，因此以比色法测定总酚酸含量是可行的32,43。3.3实验中曾以丹酚酸B为对照品，采用紫外光谱法测总酚酸含量，以及分别以丹酚酸B、绿原酸为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝络合法测总酚酸含量，结果几种方法测定结果相近，且呈线性相关，说明几种方法均为有效方法，但以绿原酸为对照品方便、经济，因此最终确定采用以绿原酸为对照品测定丹参中总酚酸的含量。参考文献:1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)