2022年1蛋白质工程

1、蛋白质工程2003级硕士研究生选修课程时间：2003年10月-12月10周-17周周学时：6有关本课程的说明1. 课程的性质和任务 蛋白质工程是生物类专业的一门选修课程。2. 教学的基本要求 通过本课程的学习，要求学生掌握蛋白质工程学的基本内容和某些重要方法，了解蛋白质工程的研究进展。3. 学时 总学时40学时，课程时数分配见表1。4. 与其他课程的关系 蛋白质工程是以化学、物理化学、物理学、生物化学、分子生物学、蛋白质化学和计算机辅助设计等学科基础课和专业课为基础的，所以要求学生掌握和运用前期课程的知识。5. 推荐教材及参考书 推荐使用由化学工业出版社出版的，王大成主编的蛋白质工程为教材。其

2、他主要参考书：高等教育出版社出版，陶慰孙 李惟 姜涌明 主编蛋白质分子基础6. 主要教学方法与媒体要求 本课程采用课堂教学和讨论相结合，采用多媒体教学方式。 表1 蛋白质工程课程教学时数分配表课 程 内 容 讲 课讨论学时第一章 蛋白质结构基础44第二章 蛋白质分子设计426第三章 蛋白质的修饰和表达426第四章 突变蛋白质的物理化学性质分析426第五章 天然和重组蛋白质结构测定426第六章 蛋白质的化学合成426第七章 蛋白质工程的应用426 小 计281240课程内容 绪论 蛋白质工程的诞生，蛋白质工程主要研究内容和基本研究目的第一章 蛋白质结构基础 蛋白质结构的基本组件 蛋白质结构的组织

3、和主要类型 蛋白质结构的形成多肽链的生物合成与折叠 第二章 蛋白质分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计 全新蛋白质设计 蛋白质的功能设计 计算蛋白质设计第三章 蛋白质的修饰和表达 蛋白质修饰的化学途径 蛋白质改造的分子生物学途径 重组蛋白质的表达 第四章 突变蛋白质的物理化学性质分析 蛋白质溶液的热力学 蛋白质折叠动理学 突变、稳定性和折叠第五章 天然和重组蛋白质结构测定 X射线晶体结构分析 核磁共振波谱的溶液结构解析 蛋白质结构预测 第六章 蛋白质的化学合成 蛋白质的液相合成 蛋白质的固相合成 第七章 蛋白质工程的应用 医用抗体的蛋白质工程 组织纤维蛋白溶酶原激活因子的蛋白质工程 基于蛋白质

4、结构的小分子药物设计讨论专题蛋白质工程研究现状蛋白质数据库介绍(蛋白质分类数据库)蛋白质工程应用实例蛋白质构象的研究方法包涵体表达蛋白质的复性蛋白质折叠的研究进展 绪 论1. 蛋白质工程的诞生1978年，美国Hutchison使用了Lederberg于1960年推荐使用的寡脱氧核糖核苷酸作为体外诱变剂，成功地实现了定位突变(Sitedirected mutagenesis)试验，培育出了多种具有生物学特性的突变株。1981年，美国Gene公司厄尔默(KU1mer)则将此定位突变试验冠以“蛋白质工程”。经过多年的发展，蛋白质工程已经成为生命科学中的一个重要分支，它的定义是：通过蛋白质化学、蛋白质

5、晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。2. 蛋白质工程主要研究内容蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：（1）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；（2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新

6、的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 1 蛋白质结构基础1.1 蛋白质结构的基本组件1.2 蛋白质结构的组织和主要类型 1.3 蛋白质结构的形成多肽链的生物合成与折叠引 言蛋白质工程的基本目标：按照预期的结构和功能，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 无论是改造现有蛋白质还是从头设计合成全新蛋白质，都必须以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，以天然蛋白质分子的三维结构为基本蓝图。任何一个蛋白质，在其自然状态或活性形式下，都具有特征而稳定的三维结构（空间结构，立体结构）；具有独特

7、三维结构是功能蛋白质分子最基本的属性。2001年10月国际蛋白质数据库公布：在原子或接近原子分辨率水平解析的蛋白质三维结构数量已超过16 000。蛋白质三维结构具有极大的多样性和极高的复杂性。“千人千面”决定功能的多样性。结构之间的共同特征结构组件、多层次的结构组织方式和结构域水平上的结构类型。1.1 蛋白质结构的基本组件不同蛋白质间最基本的差别：组成多肽链的氨基酸序列和长度的不同。各类蛋白质结构中存在一些共同的组件，构成了蛋白质分子的基本要素，也是设计和构建新蛋白质的主要基础。本节概要介绍目前已知的蛋白质结构的化学和空间的基本组件。 1.1.1 20种天然常见氨基酸组成蛋白质的氨基酸1基本结

8、构 除了脯氨酸之外，其余19种氨基酸可用通式表示。 各种氨基酸结构上的差别在侧链R的化学结构上。 脯氨酸的侧链与氮原子相接形成亚氨基酸 组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸CHH2NCOOHR碳原子,不对称碳原子侧链二十种氨基酸除Gly外全是L-型。氨基酸通式2. 基本性质（1）疏水性氨基酸 Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp侧链基本无化学反应性共同特性：疏于与水相互作用，趋于彼此间或与其他非极性原子相互作用紧密堆积在蛋白质分子内部，形成疏水内核，是稳定蛋白质三维结构的主要因素疏水相互作用是多肽链折叠（folding）的原始推动力。Pro残基不常出现在分子内部，对各肽链的

9、构象有重要影响（侧链与主链N原子共价相联，对N-C的旋转形成制约）。（2） 极性氨基酸 Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、His、Tyr、Trp 侧链为极性基团，为氢键的给体或受体，可参加化学反应蛋白质结构中Cys经氧化形成二硫键，需要一个氧化环境。二硫键一般不存在于细胞内蛋白质中，因为是还原环境。二硫键常常出现在由细胞分泌出来的胞外蛋白质中。真核生物中二硫键是在内质网的间隙中形成。二硫键可稳定蛋白质的三维结构，稳定单肽链的折叠，使蛋白质不被降解蛋白质工程中通过定位突变在酶分子中引入二硫键，以提高酶的热稳定性，应用于工业生产。Tyr和Trp及非极性残基Phe具有芳香性侧链，是使蛋白质产生

10、紫外吸收和荧光特性的主要因素。Tyr和Trp对环境特别敏感，常常作为蛋白质结构变化的探针。 Trp、Tyr和Phe的紫外吸收氨基酸光吸收荧光发射max/nm摩尔吸收max/nmPheTyrTrp257.4274.6279.819714205600282303348表1 氨基酸残基的一些理化性质（3）荷电氨基酸 Asp、Glu、Arg、Lys侧链在生理条件下都可以解离。Asp和Glu离解为电负性基团（带负电荷），也可以整合金属离子。Lys的侧链具有很强的亲核性，侧链氨基易发生酰化、烷化、芳香化和唑基化等反应。Arg侧链由3个非极性的甲基和1个强碱性的胍基构成，pKa值约为12，其胍基在天然蛋白质

11、存在的整个pH范围都是解离的。解离的胍基由于共振呈平面，其正电荷分离于整个基团。在质子化形成中，胍基无反应性，在生理pH只有很少量的非解离胍基存在。 3. 单一构型和旋转异构体（1）构型与构象（configuration和conformation）构型：分子中原子的特定空间排布；构型的改变必须涉及共价键的断裂与形成。构象：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。（2）天然蛋白质中氨基酸的单一构型L型氨基酸（图）（3）优势构象与旋转异构体交错构象（stagged conformation）是能量上最有利的排布蛋白质中，大多数氨基酸残基的侧链都有一种或少数几种交错构象作为优势构象出现在

12、天然蛋白质中，称为旋转异构体（rotamer）。 L型氨基酸 与 D型氨基酸L- amino acidD- amino acid alanine 丙氨酸 AlaA arginine 精氨酸 ArgR asparagine 天冬酰胺 Asn AsxN aspartic acid 天冬氨酸 Asp AsxD cystine 半胱氨酸 CysC glutarmine 谷氨酰胺 Gln GlxQ glutarmic acid 谷氨酸 Glu GlxE glycine 甘氨酸 GlyG histidine 组氨酸 HisH isoleucine 异亮氨酸 IleI leucine 亮氨酸 LeuL ly

13、sine 赖氨酸 LysK methionine 甲硫氨酸 MetM phenylalanine 苯丙氨酸 PheF proline 脯氨酸 ProP serine 丝氨酸 SerS threonine 苏氨酸 ThrT tryptophan 色氨酸 TrpW tyrosine 酪氨酸 TyrY valine 缬氨酸 ValV英文名称 中文名称 三字符号 单字符号COOHCHCH2H2NH2CCOHH羟脯氨酸 COOH CH H2N CH2 CH COOH HOOC -羧基谷氨酸 COOH CH H2N CH2OPOOHHO磷酸丝氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH2-羟赖氨酸

14、H2N COOHHHHHHHHOOOR1R2R3Rn1.多肽链结构肽键肽单位肽键：peptide bond 肽单位：peptide unit1.1.2 肽单位和多肽链多肽链（polypeptide chain）是由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的。1.2.1 肽链和肽单位2. 肽单位特征（1）肽键的键长是0.1325nm，比CN单键（键长0.147nm）短些，比C双键（键长0.127nm）长些。因此，肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。（2）肽单位是刚性平面结构，肽单位上的6个原子都位于同一个刚性平面上。（3）在肽单位上，CO与NH或者CC与CN虽然可以有顺式和反式两种排布，但是，实际上

15、除含Pro的肽单位以外，多肽链上绝大多数肽单位，其CO与NH都是反式排布的。（能量低）（4）肽单位平面结构有一定的键长和键角。CC双键CC单键1.1.3多肽链的构象 扭角（torsion angle）或双面角（dihedral angle）系统表示Ramachandran构象图C2C2C2位于二个肽单位（又称肽平面或酰胺平面）的交线上。C2上的两个单键可以围绕键轴自由旋转。其中，C2N1单键的旋转角度用表示；C2C2单键的旋转角度用表示。由于和这两个构象角决定了相邻两个肽平面在空间上的相对位置，因此，称为二面角（dihedral angle）。1. 二面角的定义 N2C1N1H1O22. 有关

16、二面角的一些规定（1）二面角（； ）可以在0180范围内变动。（2）在相邻的两个肽平面上，当C2C2与N1H1呈反式排布时，规定 =0； C2C2与N1H1呈顺式排布时，规定= 180；当C2N1 与C2O2呈反式排布时，规定 =0；当C2N1 与C2O2呈顺式排布时，规定 =180。（3）从-碳原子（ C2 ）向C2N1的N1或C2C2的C2原子看，单键按顺时针方向旋转的角度，用“+”表示；单键按逆时针方向旋转的角度用“”表示。（4）肽键虽然具有部分双键的性质，但在某些情况下，可以作小幅度的扭转，其角度称为角。（1）多肽链中所有的肽单位基本上都具有相同的结构；每个 -碳原子及其相连的4个原子

17、都呈现正四面体构型。因此，多肽链主链骨架的构象是由一系列的-碳原子的成对二面角（ ； ）所决定的。（）在多肽链中，任何-碳原子的二面角（ 或 ） ，如果发生了变化，则多肽链主链骨架的构象必然发生相应的变化。如果所有的-碳原子的二面角（ ； ）都分别相等，则多肽链主链骨架的构象，一般是螺旋构象，例如： =57， =47，是3.613-螺旋。如果所有 -碳原子的二面角都分别等于180，则多肽链主链骨架是充分伸展的构象。3. 二面角与多肽链主链骨架构象的关系4. 拉氏构象图 二面角决定多肽链主链骨架的构象；二面角改变了，则构象也随之改变。但是，不是任意二面角所决定的构象都是立体化学所允许的，这主要取

18、决于： 在相邻两个肽单位的构象中，非键合原子之间的接触距离有无空间阻碍？即能量是否达到最低？如果有空间阻碍，则此构象就不稳定；决定该构象的相应的二面角，是不能允许的。如果没有空间阻碍，则此结构稳定；决定该构象的相应的二面角是允许的。二面角的变动，受到下列因素限制：（1） CC与NH单键的旋转，将会受到 -碳原子上R侧链的空间组胺，其影响程度取决于R侧链的性质；（2）在相邻的二个肽平面上，二个羰基氧原子之间，或者二个亚氨基氢原子之间，或者羰基氧原子与亚氨基氢原子之间，发生空间障碍。由于各种各样不利的空间阻碍，真正能够存在的构象为数有限。1960年代，Ramachandran等人针对构象中所碰到的

19、空间阻碍问题，作了近似的处理。把原子看作是简单的刚球，根据范得华半径计算，确定了非键合原子之间的最小接触距离。非键合原子之间的最小接触距离（nm） C N O H C 0.32（0.30） 0.29（0.28）0.28（0.27）0.24（0.22）N 0.27（0.26）0.27（0.26）0.24（0.22）O 0.27（0.26）0.24（0.22）H 0.20（0.19）括号内是Ramachandran测得的数据，其他是由范德华半径计算得到的数据。根据非键合原子之间的最小接触距离，确定哪些成对二面角所决定的相邻二肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，作出构象图，称为拉氏图。拉氏构象图（

20、根据多聚L-Ala而制作）深兰色区域是允许的。此区域内，成对二面角所决定的主链骨架构象是允许的。在此构象中非键合原子之间的距离最小接触距离。二者无斥力，构象的能量最低。右手-螺旋、平行-折叠，反平行-折叠，以及胶原三股螺旋位于允许区内。兰色之外的广大区域是完全不允许区域。浅兰色区域是部分允许区（临界限制区）。310-螺旋、-螺旋以及左手-螺旋位于此区内。相邻二个肽单位上非键合原子的接触距离太近1.1.4 螺旋（-helix）螺旋（-helix）是首先被肯定的蛋白质空间结构的基本组件，普遍存在于各种蛋白质中。1951年美国加州理工学院Pauling提出，Max Parutz在肌红蛋白和角蛋白的X

21、射线分析支持，1959年John Kendrew在肌红蛋白的晶体结构中证实 1.1.4.1 螺旋结构 多肽链主链骨架围绕一个轴一圈一圈地上升，从而形成一个螺旋式的构象。此构象称为螺旋结构。如果每一圈所包含的氨基酸残基数是整数（比如：3个残基），那么，该螺旋为整数螺旋；如果每圈的残基数是非整数（比如：3.6个残基），该螺旋就是非整数螺旋。根据主链骨架沿螺旋旋转的方向不同，分为左手螺旋（left-handed helix）和右手螺旋（right -handed helix ）。 在螺旋构象中，主链骨架的CO基氧原子与NH的氢原子可以生成氢键。螺旋构象是依靠氢键来维持的。 按照氢键形成方式的不同，可

22、以把螺旋分成两大类；-系螺旋和-系螺旋。（1）在 -系螺旋中，每一个氢键所封闭的环是： n 封闭环本身的原子数是3n+4，n=1，2，3，。从多肽链的N末端出发，n表示：在主链骨架上，每个肽单位的C=O基氧原子与其前的第n个肽单位的NH基氢原子生成一个氢键。例如：n=3，指主链骨架上，每个肽单位的C=O基的氧原子，与其前的第3个肽单位的NH基氢原子生成氢键，其中氢键所封闭的环本身的原子数是13（33+4=13）。几种螺旋构象的氢键排布方式 这些螺旋，可以用SN表示。S表示每一圈所包含的氨基酸残基数；N表示氢键封闭环本身的原子数。例如：310-螺旋，S=3，N=10；（2）在 -系螺旋中，每一个

23、氢键所封闭的环是： N n 封闭环本身的原子数是3n+5，n=1，2，3，。从多肽链的N末端出发，n表示：在主链骨架上，每个肽单位的NH基氢原子与其前的第n个肽单位的C=O基氧原子生成氢键。例如：5.717-螺旋（ -螺旋），n=4，指主链骨架上，一个残基的NH基氢原子与其前的第4个残基的CO基的氧原子生成氢键，其中氢键所封闭的环本身的原子数是17（34+5=17）。2. -螺旋（ -helix） -螺旋，即3.613-螺旋，是非整数螺旋 每一圈包含3.6个残基，螺距0.54nm，残基高度0.15nm，螺旋半径0.23nm。 每一个=57 ，每一个=47 。 相邻螺圈之间形成链内氢键。即每一个

24、羰基氧与其前的第3个肽单位的NH上的氢生成一个氢键。氢键的取向与螺旋几乎平行。氢键封闭环本身包含13个原子。 -螺旋允许所有的肽键都能参与链内氢键的形成，因此， - 螺旋构象是相当稳定的。（1） -螺旋结构特征 与-碳原子相连的R侧链，位于 -螺旋的外侧。R侧链对 -螺旋的形成和稳定性有较大的影响。 如果在多肽链上，连续存在带相同荷电基团的氨基酸残基（如Lys或Asp、Glu），则螺旋构象就不稳定；然而，当这些氨基酸残基分散存在时，就不影响 -螺旋的稳定性。 Gly残基，由于没有侧链的约束，其角与角可以任意取值，从而，使形成 -螺旋所需要的二面角的机率很小。因此，当它在多肽链上连续存在时，则

25、-螺旋就不能形成。 Pro残基（2）R侧链的影响 Pro残基，由于其N原子位于刚性的吡咯环上，其CN单键不能旋转，因而，不可能得到形成 -螺旋所需要的角；加上Pro残基没有NH基，其侧链又阻止其C=O基接近主链骨架的NH基。因而，不可能形成维持 -螺旋构象所需要的氢键。所以，Pro是 -螺旋的最大破坏者。胶原蛋白含有大量的Pro和羟脯氨酸残基（占1/4），以及大量的Gly残基（占1/3）。因而，在胶原蛋白分子中，不可能存在 -螺旋。丝心蛋白含有50%的Gly残基，因而，它也不可能存在 -螺旋。（3）右手-螺旋是稳定的构象 螺旋构象形式：2.27-、310-、3.613-、4.410-螺旋以及-

26、螺旋。右手-螺旋完全符合立体化学规则，能量最低，因此，右手-螺旋最易生成，最稳定。它存在于大多数蛋白质中。到目前为止，仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一个左手-螺旋。它是由226229残基形成的=64 ；=42 。（4）非典型的 -螺旋 除了上述典型的右手 -螺旋（ II）之外，在蛋白质中还存在许多非典型的 -螺旋（ II），它于前者的区别是，形成氢键的N、H、O三个原子不在一条直线上，且距直线甚远，这样就难以形成第二圈螺旋。因此，在很多圈的 -螺旋结构中，末端一圈往往形成 II 。例如：在溶菌酶、胰岛素以及肌红蛋白的构象中，都有这种情况。3. 310-螺旋和-螺旋（1） 310-螺旋（ 310 -h

27、elix） 310 -螺旋是整数螺旋； 每一圈包含3个残基，残基高度0.20nm，螺旋半径0.19nm。 每一个=49 ，每一个=26 。 每个肽单位的羰基氧与其前的第2个肽单位的NH上的氢生成一个氢键。 氢键封闭环本身包含10个原子。 R侧链伸向螺旋外侧。 310 -螺旋不够稳定，通常大约一圈，倾向于 -螺旋的N-或C-末端，在一些蛋白质中只有少量存在。（2） -螺旋（ -helix） -螺旋又称为4.416 -螺旋，是非整数螺旋； 每一圈包含4.4个残基，残基高度0.11nm，螺旋半径0.28nm。 每个肽单位的羰基氧与其前的第4个肽单位的NH上的氢生成一个氢键。 氢键封闭环本身包含16个

28、原子。 -螺旋不够稳定，蛋白质中极少存在。最近，仅在过氧化氢酶中发现它的存在。1.1.5 层（-sheet） 1. -折叠股（ -sheet strand） -折叠股是一种较伸展的锯齿形的主链构象，但并不完全伸展。 由于主链中所有-碳原子的二面角都取 = 12045、=+130 30 ，从而使主链呈现周期性折叠构象。 -折叠股可以参与 -折叠片的构成。 还可以与-螺旋或无规则卷曲交替连接，构成一些有规律的超二级结构。2. -折叠片（ -pleated sheet ）二条 -折叠股平行排布，彼此以氢键相连，可以构成 -折叠片。 -折叠片又称为 -折叠、 -折叠层等。为了在相邻主链骨架之间形成最多

29、的氢键，避免相邻侧链间的空间障碍，各主链骨架同时作一定程度的折叠，从而产生一个折叠的片层。其侧链近似垂直于相邻两个平面的交线，交替地位于片层的两侧。（1） 平行 -折叠片（parallel - pleated sheet ） 所有的肽段，走向相同（即：它们的N末端都在同一端）； = 119、=+113 ； 氢键与氢键之间的间隔相同，交错倾斜。（2） 反平行 -折叠片（anti-parallel - pleated sheet ） 所有的肽段，彼此走向相反； = 139、=+135 ； 氢键与氢键之间的间隔有疏有密，彼此平行。 从能量上，反平行的比平行的更加稳定。因为前者所形成的氢键N、H、O三

30、个原子几乎位于同一条直线上，此时氢键最强。 Pauling等人提出的 -折叠片是平面的。实际上，除了谷胱甘肽还原酶等极少数蛋白质中发现这种平面的 -折叠片外，大多数蛋白质的 -折叠片都是非平面的。它们是向右手方向扭曲的，变成右手扭曲片层。这些右手扭曲片层可以组建成两种几何形式：马鞍形和圆筒形。 -折叠片是一种稳定的二级结构。它们广泛地存在于各种蛋白质之中。例如：丝心蛋白含有大量的反平行 -折叠片； -角蛋白含有大量的平行 -折叠片；核糖核酸酶含有少量的平行和反平行 -折叠片。1.1.6 环肽链（loop）或回折（reverse turn）在多肽链中，经常出现180转弯的结构。此结构就是回折。通

31、常有-转角和-转角两种形式。1. -转角（ -Turn ） 由多肽链上4个氨基酸残基组成； 主链骨架以180返回折叠； 第一个肽单位上的羰基氧与第三个肽单位上亚氨基氢原子生成一个氢键；C1与C 4之间的距离小于0.7nm。分为I型和II型两种。I型中，中间肽单位的羰基与其相邻的二个R侧链呈反方向排布，2=60 ，2= 30 ， 3 =90 ，3= 0II型中，中间肽单位的羰基与其相邻的二个R侧链呈同方向排布，2=60 ，2= 120 ， 3 =80 ，3= 0因为R3侧链与中间肽单位上的羰基氧之间存在较大的空间障碍，II型转角不稳定；只有在第三个氨基酸残基是Gly时，II型才是稳定的。2. -

32、转角（ -Turn ） 由多肽链上3个连续的氨基酸残基组成； 主链骨架以180返回折叠； 依靠两个氢键维持构象。第一个肽单位上的羰基氧和亚氨基氢分别与第三个肽单位上亚氨基氢原子和羰基氧原子生成氢键； -转角能够连接反平行 -折叠片中的两股链三股螺旋（triple helix）又称为胶原螺旋（collagen helix）、超螺旋（super helix） 包含3条多肽链。每一条多肽链的主链骨架略微向左扭转，生成左手螺旋。 三股左右螺旋平行排列，相互绞合、生成右手螺旋。 链间依靠氢键和范德华引力维系。 =60 ，= 140 三股螺旋存在于胶原蛋白中。三股螺旋示意图无规卷曲（random coil

33、） 没有规律性的多肽链主链骨架的构象，就是无规卷曲。 球蛋白分子中，往往含有教多的无规卷曲。 无规卷曲与生物活性有关，对外界理化因子极为敏感。疏水内核蛋白质结构具有1个共同的特征：分子内部都有1个由紧密堆积的疏水侧链构成的疏水内核。疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力和天然蛋白质稳定的基本结构因素。1.2 蛋白质结构的组织和主要类型 蛋白质的分子结构蛋白质具有三维空间结构，执行复杂的生物学功能，结构与功能之间有密切关系。 天然蛋白质各有其特殊的生物学活性，肽链的氨基酸序列决定了每一种蛋白质的生物学活性的结构特点，由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它

34、们按照不同的序列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。为了研究方便，将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构4个层次，同时在二、三级结构间又划分出超二级结构和结构域。1.2.1 蛋白质结构的层次体系1. 2.1.1 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指蛋白质中氨基酸的排列顺序。1953年英国Sanger等人，完成了牛胰岛素(Isulin)一级结构测定工作，分子量为5700D，有A链(21Aa)和B链(30Aa)两条肽链，两个链间有二硫键和一个链内二硫键(A链)。1960年Stanford Moore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)的分析， RN

35、ase由一条含124个氨基酸残基的多肽链组成，分子内含有4个链内二硫键，分子量为12600。它是水解核糖核酸磷酸二酯键的酶。血红蛋白(hemoglobin) 结构的研究是另一大成就，血红蛋白分子是一个四聚体，它是由4条称珠蛋白(globin)的多肽链(亚基)借非共价键连接聚集而成，其中两条是相同的链(141个残基)，另两条是相同的链(146个残基)。1967年Edman等发明的氨基酸序列分析仪；1973年Moor等制造的氨基酸自动分析仪极大地推动了氨基酸序列测定的进度。目前已对上千种蛋白质的一级结构进行了测定。蛋白质一级结构中Aa顺序测定的一般步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目。根据N-端或C-

36、端的摩尔数和蛋白质分子量来确定。拆分蛋白质分子的多肽。由非共价键连接起来的几条肽链可用变性剂（尿素或盐酸胍）处理；如果肽链间（或链内）有二硫键交联，则必须先将二硫键打开，即用过量的巯基乙醇处理，将-SS- 还原为-SH。测定多肽链的Aa组成。样品完全水解后测其Aa组成，计算Aa成份成份的分子比。分析多肽链的N-末端和C-末端残基。将多肽链断裂成肽段，测定各肽段的Aa顺序。确定肽段在多肽链中的顺序。确定原多肽链中二硫键的位置。 也可根据cDNA推断出蛋白质的结构。蛋白质分子的多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的比较稳定的空间结构。蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整，因

37、此仅仅测定蛋白质分子的氨基酸组成和它们的排列顺序并不能完全了解蛋白质分子的生物学活性和理化性质。1.2.1.2 蛋白质的二级结构(secondary structure)多肽链(polypeptide chain)多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象。多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。 为了使暴露在多水介质中的疏水基团降低到最小程度，同时保持多肽链与周围水分子之间形成的氢键相互作用的有利能量状态，多肽链自发折叠形成由氢键维系的有规则的重复构象，从而产生蛋白质的二级结构。1.2.1.3 结构模体在蛋白质中常常发现，一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近

38、，彼此按特定的几何排布形成简单的组合，可以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体（motif，structural motif）。结构模体是一类超二级结构（supersecondary structure），是三级结构的建筑模块。有的模体与特定的功能相关，如与DNA结合；许多模体没有专一的生物功能，只是大结构和组装体的一个组成部分。1. 螺旋-转折-螺旋模体（ helix-turn-helix motif ）简称HTH，或称为螺旋-环链-螺旋HTH DNA结合模体在DNA 结合蛋白 Cro、阻遏蛋白以及代谢分解物基因活化因子（CAP）中发现，并由Brian Matthews

39、首先在 Cro的结构分析中提出其专一地结合DNA的模型。钙结合模体：出现在小白蛋白、钙调蛋白、肌钙蛋白C及其他与钙结合的蛋白中。2. 发夹式模体（hairpin motif）两段相邻的反平行链被一环链连接在一起构成的组合，取其形貌与发夹相似，称为发夹式模体，也称为-组合单位。3. 反平行层回纹模体4段反平行链以特定的来回往复方式组合，其形貌类似于古希腊钥匙上特有的回形装饰纹，被称为Greek key motif。4. -模体（ - motif ）这是一种连接两股平行链的结构元素组合。链1-环链1- 螺旋-环链2- 链2。两个环链区具有不同的作用，一般连接链的羧基端与链的氨基端的环肽链常常是蛋白

40、质功能结合部位或活性位置的组成部分，在同源蛋白质中其序列是保守的。5. 复杂模体（complex motif）两个相邻的发夹型模体通过环链相连，构成更复杂的模体，其组合方式共24种。超二级结构 1973年，Rossom提出了超二级结构的概念。二级结构单元（-折叠股和-螺旋）相互聚集，形成更高一级的有规律的结构。此结构就是超二级结构。超二级结构主要涉及-螺旋及 -折叠股在空间上是如何聚集在一起的问题。 超二级结构的类型：复绕 -螺旋、x、 -迂回、 -折叠筒、 -螺旋- -转角- -螺旋等5种复绕 -螺旋（coiled-coil -helix） 两个 -螺旋互相缠绕，形成一个左右超螺旋。其周期距

41、离为14nm，侧链互相齿合。 大多数疏水侧链分布在螺旋的同一侧，并埋藏在两个螺旋的接触面上。两个螺旋借疏水侧链的疏水作用而互相结合。自由能很低。因此，复绕 -螺旋很稳定。 它存在于 -角蛋白等纤维蛋白中。但在一些球蛋白中，如烟草花椰病毒外壳蛋白、蚯蚓血红蛋白中有此结构。超二级结构x -单元（ x -unit） 由两条平行的 -折叠股，通过一个x结构的连接而形成的结构，称为x -单元。 在x -单元中，如果x为无规卷曲，则为c -单元；如果x为 -螺旋，则为 -单元；如果x为 -折叠股，则为 -单元。 x -单元有左手型和右手型。但在蛋白质中都是右手的。 x -单元存在于大多数球蛋白中。 超二级

42、结构两组 -单元组合在一起，生成更加复杂的超二级结构，称为Rossmann折叠，是 -单元的特殊形式。它存在于许多球蛋白中。例如苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶及枯草杆菌蛋白酶等。超二级结构复绕 -螺旋x -单元的手性A：右手交连B：左手交连Rossmann折叠超二级结构-迂回（ -meander） -折叠层由三条或三条以上的反平行的 -折叠股形成。它们中间以短链相连。此结构称为 -迂回。在蛋白质中，该结构是很常见的。如果有三条 -折叠链连续存在时，最常见的就是 -迂回。 A： -迂回 B：希腊钥匙 C：双希腊钥匙超二级结构-折叠筒（ -sheet barrel） 由多条 -折叠股所构成的 -折叠片，

43、可以卷成一个圆筒状的结构。片层两端的 -折叠股以氢键相连。筒中心由疏水侧链组成。此结构就是 -折叠筒。在 -折叠筒中，如果所有的 -折叠股的排列方向是相同的，则为平行式 -折叠筒；如果排列是彼此反方向的，则为反平行式 -折叠筒。组成 -折叠筒的 -折叠股为5-15条。超二级结构 -螺旋-转角 -螺旋 在多肽链中两个 -螺旋可以通过一个 -转角连接在一起，形成一个超二级结构形式，称为-螺旋 -转角- -螺旋。如噬菌体的阻遏蛋白、Ecoli的CAP蛋白都含有这种结构。在蛋白质与DNA的结合中，这种结构占有重要的地位，可能是阻遏蛋白与操纵基因结合的结合部位。超二级结构 -折叠筒1.2.1.4 结构域

44、（structural-domains） 1970年，Edelman为了描述免疫球蛋白（IgG）分子的构象，提出了结构域的概念。 二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。 在较大的球蛋白分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象、彼此分开、以松散的肽链相连。此球状构象就是结构域。从球蛋白分子的电子密度图上，可以看出各个结构域的轮廓。 多肽链折叠时，每个结构域是独立地、分别地进行折叠，形成不同的结构域，然后，彼此靠拢，形成球状蛋白质分子。因此，结构域是多肽链的独立折叠单位。 不同的蛋白质含有结构类似的结构域。例如：甘油醛脱氢酶

45、、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶是具有相似功能的不同蛋白质，都含有结构相似的辅酶结构域。有一些功能完全不同的蛋白质，如：溶菌酶与乳清蛋白含有结构类似的结构域。此外，一个蛋白质分子内部也可以由结构相似的几个结构域所组成。例如：弹性蛋白酶的两个结构域具有相似的-折叠筒。这些例子说明：结构域可以作为蛋白质分子的基本结构单位。Gilbert和Blake假设：DNA的外显子与蛋白质的一个功能单位或结构单位相应，而结构域往往是蛋白质的结构单位，有时，也是一个功能单位。必然将DNA的外显子与结构域对应起来，如IgG，一个外显子编码一个结构域。结构域与功能域功能域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位。它可以由一个或几

46、个结构域组成。这些结构域可以位于一条多肽链上或者几条多肽链上。活性部位是蛋白质分子的功能域，它往往位于结构域之间的交界处，可以由2个或2个以上的结构域所组成。例如：胰凝乳蛋白酶分子的活性部位存在于结构域1与结构域2之间的裂隙中。有些蛋白质分子，含有不同的结构域。每个结构域都是独立的功能域，各自具有特殊的生理功能。例如；大肠杆菌E3的A亚基包含M、N、C3个不同的结构域。在大肠杆菌杀菌过程中，这3个结构域执行不同的生理功能：M域能识别受体；N域能透过膜；C域能使核蛋白体失活。结构域运动每个结构域本身都是紧密装配的。结构域之间是通过共价的、松散的肽链相联系。由于这种牢固而又柔韧的连接方式，使得每一

47、个结构域可以作为一个整体，作较大幅度的相对运动。当酶与底物结合时，两个结构域会发生性队运动，使裂隙关闭。结构域的这种运动，可以使催化基团定向地包围底物，辨认出不合适的底物，并从活性部位上排出水分子。结构域分类根据结构域中二级结构的种类、数量以及排布，可以将结构域分成5种类型。 1. -螺旋域： 结构域中所含的结构单元主要是 -螺旋。例如：木瓜蛋白酶的结构域1。 2. -折叠域： 结构域主要由反平行的 -折叠构成。例如：木瓜蛋白酶结构域2。 3. + 域：结构域由 -螺旋和 -折叠股不规则堆积而成。例如：乳酸脱氢酶结构域2。 4. / 域：结构域的中央主要是 -折叠片，周围是 -螺旋。 -螺旋与

48、 -折叠股交替排布。例如：乳酸脱氢酶结构域1，磷酸甘油酸激酶结构域2。 5. 无 -螺旋和 -折叠域： 结构域不具有或仅具有少量的 -螺旋和 -折叠。如：麦胚凝集素。结构域分类-螺旋域结构域分类-折叠域结构域分类/域结构域分类+域结构域(domain)在空间上相对独立IgG分子的12个结构域1.2.1.5 三级结构（tertiary structure）结构域在三维空间中以专一的方式组合排布，或者二级结构、结构模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布，这就是蛋白质的三级结构。1.2.1.6 四级结构（quaternary structure

49、）最早指：蛋白质分子的亚基结构。多亚基蛋白中亚基的数目、类型、空间排布方式和亚基间相互作用的性质都属于蛋白质四级结构的基本内容。许多蛋白质是以复合物、组装体作为完整的功能单位，其间所有三级折叠单位的组织方式也应纳入蛋白质的四级结构的范畴。1.2.2 蛋白质结构分类1.2.2.1 按结构域分类随着已知蛋白质结构数量的增加，系统地比较研究发现，在结构域中结构模体的组织方式是有限的，而且一些组合具有明显的优势，常常出现在功能和序列都不相同的蛋白质中，使蛋白质的域结构表现出一些主要的类型。M.Levitt等在结构域水平将蛋白质的域结构划分为5类。 1. 型结构： 蛋白质主要由 -螺旋组成，其螺旋含量6

50、0%-80%。肌红蛋白、血红蛋白、烟草花叶外壳蛋白、细胞色素b5等。 2. 型结构： 主要由反平行的 -折叠构成柱状或圆桶状。例如：丝氨酸属水解酶、免疫球蛋白A、一些球状的RNA病毒外壳蛋白等。 3. + 型结构：结构由 -螺旋和 -折叠股不规则堆积而成。例如：溶菌酶、嗜热菌蛋白酶、核酸酶等。 4. / 型结构：结构域的中央主要是 -折叠片，周围是 -螺旋，主要是 - -模体的组合 。 例如：乳酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶等。 5. 无规型/富含二硫键和金属离子型： 小蛋白分子，没有典型的二级结构，或二级结构没有明显的规律可循。1.2.2.2 系统性分类数据库SCOP、CA

51、TH、DALI/FSSP/DDD1. SCOP（Structure Classification of Proteins）按进化起源和结构类似性将蛋白质结构分层次组织在一个体系中。分类层次： 蛋白质（名称） 类型（所属结构域类型） 折叠类型 家族（结构域具有显著结构、功能和序列相似性，显示出有共同的进化起源的蛋白质群） 超家族（具有共同的结构与功能，但没有足够序列相似性的家族）2. CATH（Class，Architecture，Topology， Homologous Superfamily）类似于SCOP的分类模式。层次：类型、构造、拓扑学、同源超家族、序列家族和结构域。3.FSSP和DD

52、D基于一个结构比较程序DALI的有效应用。DALI是L.Holm和C.Sander发展的快速进行结构比较的方法和计算程序，从不同蛋白质的原子坐标出发辨识它们间最大的共同亚结构及其残基比对（alignment）。FSSD（Fold classification based on Structure-Structure alignment of Protein）：基于结构-结构比对的蛋白质折叠分类。DDD（DALI Domain Dictionary）：DALI结构域词典，它包含从已知结构自动抽提出来的结构域的归并分类。1.3 蛋白质结构的形成多肽链的生物合成与折叠 蛋白质的生物合成分为2个阶段：

53、多肽链的生物合成（在遗传密码指导下将氨基酸按特定序列在核糖体上连接起来，形成只有一维结构的多肽链）；新生肽链的折叠或蛋白质折叠。1.3.1 多肽链的生物合成复习生物化学中蛋白质的生物合成内容。蛋白质的生物合成蛋白质生的合成（翻译，Translation）是把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质中的氨基酸排列顺序的过程。参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，主要由mRNA、tRNA、核糖体以及有关的酶和蛋白因子组成。蛋白质是由20种氨基酸合成的。某些蛋白质中含有羟脯氨酸、羟赖氨酸、-羧基谷氨酸等，都是在肽链合成后的加工修饰过程中形成的。 氨基酸在核糖体上缩合成多肽链是通过核糖体循环而实现的。

54、此循环可分为肽链合成的起始(initiation)，肽链的延伸(elongation)和肽链合成的终止(termination)三个过程。蛋白质的生物合成1.3.1 氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成在蛋白质生物合成中，各种氨基酸在参入肽链之前必须先经活化，然后再由其特异的tRNA携带至核糖体上，才能以mRNA为模板缩合成肽链。氨基酸活化后与相应的tRNA结合的反应，是由特异的aaRS催化的。 蛋白质的生物合成氨基酸的活化反应aaRS催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与aaRS结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到特异tRNA的氨

55、基酸臂上。蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成原核细胞中起始氨基酸（Met）活化后，需经甲酰化形成fMet-tRNA。真核细胞无此过程。蛋白质的生物合成1.3.1.2 肽链合成的起始三元复合物(trimer complex)的形成在起始因子3(IF3)介导和IF-1促进下，核糖体30S小亚基附着于mRNA的起始信号部位，形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。蛋白质的生物合成mRNA上位于AUG的上游813个核苷酸处有一短的SD序列（Shine-Dalgarno，核糖体结合序列），它与30S小亚基16S rRNA的3端部分序列互补，是核糖体结合位点。SD序列可使核糖体选择mRNA上AUG的正确

56、位置起始肽链合成。蛋白质的生物合成30S前起始复合物的形成在IF2作用下， fMet-tRNA Met与mRNA分子中的起始密码子(AUG或GUG)相结合（密码子与反密码子反应）。同时IF3从三元复合物脱落，形成30S前起始复合物：IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNAMet复合物。蛋白质的生物合成70S起始复合物形成50S亚基与30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物：30S亚基-mRNA-50S亚基-fMet-tRNAMet复合物。蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成此时fMet-tRNA Met占据着50S亚基的P位，而50S的A位暂空，有待于对应mRNA中第二

57、个密码的相应氨酰-tRNA进入，从而进入延长阶段。蛋白质的生物合成1.3.1.3 肽链的延长肽链的延长包括：进位、肽键形成、脱落和移位等过程。肽链合成的延长需两种延长因子(Elongation factor，EF）EF-T和EF-G以及GTP供能。蛋白质的生物合成进位在GTP、EF-T等参与下，新的氨酰-tRNA进入50S大亚基A位，并与mRNA分子上相应的密码子结合。结合在mRNA上的fMet-tRNAMet（或肽酰-tRNA ）占据着P位点，新进入的氨酰-tRNA则结合到A位点，并与mRNA上第二个密码子结合。蛋白质的生物合成转肽在大亚基上肽酰转移酶催化下，P位点上tRNA携带的甲酰蛋氨酰

58、基(或肽酰基)转移给A位上新进入的氨基酰-tRNA的氨基酸，即P位上的氨基酸(或肽的3端氨基酸)的-COOH基，与A位上的氨基酸的-NH2基形成肽链。在P位点上的tRNA成为无负载的tRNA，而A位上的tRNA负载着二肽酰基（或多肽酰基）。蛋白质的生物合成移位50S亚基P位上无负载的tRNA脱落。在EF-G和GTP的作用下，核糖体沿mRNA链(53)相对移动。每次移动相当于一个密码子的距离，使下一个密码子能准确定位于A位点。原来处于A位点上的二肽酰tRNA转移到P位点上，空出A位点。蛋白质的生物合成随后再依次进位、转肽和移位进行下一循环。延长过程每重复一次，肽链延伸一个氨基酸残基。多次重复使肽

59、链增长到必要的长度。肽链的延伸是从N端开始的。 蛋白质的生物合成1.3.1.4 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止，需终止因子或释放因子(releasing factor，RF)参与。RF可识别mRNA链上终止密码子，使肽链释放，核糖体解聚。 蛋白质的生物合成当mRNA上肽链合成终止密码子出现在核糖体的A位点上。终止因子（RF）可识别终止密码子，并在A位点上与终止密码子相结合，从而阻止肽链的继续延伸。蛋白质的生物合成终止因子可使核糖体P位点上的肽酰转移酶发生变构，酶活性从转肽作用变为水解作用，使tRNA所携带的多肽链与tRNA之间的酯键被水解切断，多肽链从核糖体及tRNA释放出来。核糖体与mR

60、NA分离；在核糖体P位上的tRNA和A位上的RF脱落。在IF3的参与下，与mRNA分离的核糖体又分离为大小两个亚基，可重新投入另一条肽链的合成过程。蛋白质的生物合成mRNA链上同时结合着许多个核糖体，称为多核糖体。两个核糖体之间有一定的长度裸露的mRNA链间隔，所以多核糖体可在一条mRNA链上同时合成几条多肽链。蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成1.3.1.5 真核生物蛋白质的生物合成真核细胞的蛋白质生物合成过程和原核细胞基本类似。但参与真核蛋白质生物合成的核糖体结构、大小、组成和 mRNA的结构等不同，特别是真核细胞蛋白质合成的起始步骤更复杂。已发现的真核起始因子有近10种（eukaryote