分子量及酰基供体对酶促魔芋葡甘聚糖酰化反应的影响(共12页)

1、 燕京理工学院药物合成反应论文分子量及酰基供体对酶促魔芋葡甘聚糖酰化反应(fnyng)的影响摘 要研究了在有机介质叔丁醇中魔芋葡甘聚糖（KGM）的分子量及酰基供体对固定化脂肪酶NoVoZym435 催化KGM 乙酰化反应的影响. KGM 的分子量对酶促其酰化反应的活性及产物取代度有显著影响. 随着KGM 分子量的增大，酶催化反应的速率逐渐下降，产物的取代度逐渐减小. KGM 分子量对该反应的影响与不同分子量KGM 的溶解度、体系粘度、空间位阻及颗粒形态等因素有关. 以不同链长的脂肪酸乙烯酯为酰基供体时，随着酰基供体中脂肪酸碳链的增长，酶促KGM 酰化反应速率逐渐下降，产物的取代度逐渐减小，且该

2、酰化反应具有高度(god)的区域选择性，反应均发生在C6- OH 上.关键词：魔芋(my)葡甘聚糖 酰化反应 区域选择性 脂肪酶 分子量 酰基供体前 言魔芋葡甘聚糖（KGM）是一种来源于植物魔芋的天然多糖，由D- 葡萄糖和D- 甘露糖（按摩尔比约11. 6 ）通过!-1 ， 4- 吡喃糖苷键结合而成，在其主链甘露糖的C3 位置上往往存在着通过!-1 ，3糖苷键结合的支链结构；天然KGM 分子(fnz)除含葡萄糖和甘露糖外，可能还有微量的乙酰基存在1 !3. KGM 具有优良的生物相容性、可生物降解性和独特的理化性质. KGM 改性后因修饰基团的性质不同而具有不同的用途，可作为一种新型药物4 ，

3、5、环境友好的表面活性剂6 或药物载体7 等.糖酯可用化学方法合成，但传统的化学合成常在高温条件下进行，反应条件苛刻，且反应的区域选择性较低8 !10. 此外，化学方法合成的糖酯颜色较深（深褐色），且常因含有一些有毒的化学物质而难应用于化妆品、食品和医药工业. 与化学方法相比，酶法合成不但简单易行，环境友好，而且区域选择性高9. 相对于小分子单糖而言，国内外对多糖高分子化合物生物转化的研究甚少. 我们曾对有机介质中酶促KGM 乙酰化反应进行过研究，并考察一些因素（如有机溶剂、反应初始水活度、摇床转速、温度和酶浓度）对酶促酰化反应的影响规律11. 随着分子量的增大，高分子化合物的理化性质与其单体

4、小分子化合物的差异(chy)逐渐加大，故以其为底物的生物催化反应的特性也将呈现出明显的差异. 另据报道，不同分子量的KGM 经修饰后得到的产物具有不同的理化性质和应用价值4 -17. 因此，探讨KGM分子量大小对酶促KGM 酰化反应的影响规律(gul)具有重要的理论和实际意义. 迄今，有关这方面的研究国内外尚未见有文献报道.本文主要探讨有机介质叔丁醇中KGM 分子量及酰基供体对固定化脂肪酶NOVOZym 435 催化KGM酰化反应的影响. 其目的在于揭示底物分子量对酶促酰化反应的影响规律，丰富对酶反应、酶识别(shbi)等酶学理论问题的认识；并合成具有不同分子量、不同理化性质和应用范围的KGM

5、 酰化产物.1 实验(shyn)部分1.1 酶及主要(zhyo)试剂NOVOZym 435（10 Umg ）购自丹麦NOVOZymes公司(n s)，固定化于大孔丙烯酸树脂；天然KGM 样品（MW=980 000 ）由海南多环保健品有限公司北海分公司赠送. 不同分子量的KGM 样品由酶法降解制得12. KGM 样品使用前充分研磨，过120 目筛，备用. 乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯购自Aldrich 公司，纯度均为99 % 以上. 其他试剂均为市售分析纯试剂.1.2 酶促KGM酰化反应在25 ml 带塞的三角瓶中分别加入0. 4 g（含2. 5 mmOl 糖单

6、元）的KGM，0. 24 g 的NOVOZym435 ，7. 5 mmOl 脂肪酸乙烯酯和10 ml 叔丁醇（初始水活度0. 75 ），置于水浴恒温振荡器中（50 C，150!200 rmi n ）反应一定时间. 反应体系初始水活度（aW）的控制及产物分离参见文献11 . 反应体系粘度采用美国BrOOkfield 公司DV-I 型旋转式粘度计测定. KGM 酰化产物的取代度（DS）用皂化法测定11. 根据下式分别计算KGM 酰化产物的酯化率（C）和产物的取代度（DS）C=（Va -Vb）N（HCI ）M（RCO- ）/1000msDS= 162C/M（RCO- ）-（M（RCO- ）-1 ）C

7、式中，Va为滴定空白样品所消耗的HCl 溶液的体积（ml ），Vb为滴定被测样品所消耗的HCl 溶液的体积（ml ），N（HCl ）为HCl 标准溶液浓度（mOlL），M（RCO- ）为酰基供体中酰基RCO- 的摩尔质量（gmOl ），ms为被测样品的质量（g）.每个样品同时做3 个平行试样，取平均值为测定结果. 用该法测定的平均误差小于1 % .产物的收率Y 和反应初始速率V0分别由下式计算：Y= 162m（est ）/m（KGM）（162 + 42DS）V0 = DSt式中，m（est ）为实际分离得到的KGM 脂肪酸酯的量（g ），m（KGM）为加入的底物量（g ），DS 为酶促反应初始

8、阶段产物的取代度，t为反应时间（h）.酶促KGM 酰化反应的区域选择性主要根据酰化前后KGM 主链上葡萄糖或甘露糖残基碳原子化学位移的变化来判断. 将5 !10 mg 底物或产物溶于0. 5 ml 的六氘代二甲基亚砜（DMSO- d6）中，装入样品管，以四甲基硅烷为标准物，用德国Bruker 公司DRX-400 型核磁共振仪测定样品的13C NMR 谱.2 结果(ji gu)于讨论2.1 分子量对酶促KGM乙酰化反应(fnyng)的影响KGM 是一种高分子聚合物，不同分子量的KGM具有不同的颗粒结构和聚集状态. 这种差异影响其在溶剂中的溶解性能、运动行为及高分子溶液的流体力学(li t l x

9、u)性质（如扩散、粘度等）.本文采用脂肪酸乙烯酯为酰基供体进行酶促不同分子量的KGM 的酰化反应.表1 为叔丁醇介质中的酶促KGM 乙酰化反应. 可以看出，KGM 分子量对酶促乙酰化反应影响显著. 随着KGM 分子量的减小，反应初始速率和产物的DS 逐渐增大. 但是，总体来看，KGM 分子量为980 000 -306 000 时，酶促其乙酰化反应的活性甚低，反应初始速率及产物的DS 均较小；KGM分子量为269 000 -176 000 时，酶促其乙酰化反应表现出一定的活性；KGM 分子量为127 000-77 000 时，酶促其乙酰化反应的活性较高，反应初始速率及产物DS 均明显增大；KGM

10、 分子量为61 000-10 800 时，酶促其乙酰化反应呈现出颇高的活性，且底物分子量对反应初始速率及产物DS的影响较小.表一 叔丁醇介质中的酶促KGM乙酰化反应对于(duy)酶促KGM 酰化反应，底物在介质中的溶解度是一个非常重要的影响因素. 随着KGM 分子量的增大，其在叔丁醇中的溶解度呈降低趋势.KGM分子量为980 000 -306 000 时，其在叔丁醇中的溶解度较小；KGM 分子量为127 000 -77 000时，其在叔丁醇中的溶解度明显(mngxin)增大.反应体系的粘度对于酶促KGM 酰化反应也是一个(y )非常重要的影响因素. 高分子化合物的分子量对体系的粘度有着显著的影

11、响. 由表1 可以看出，KGM分子量为980 000 -306 000 时，虽然其在介质叔丁醇中的溶解度较低，但体系的粘度较大；KGM 分子量为127 000 -77 000 时，底物的溶解度较高，但体系的粘度较小. 这主要是由不同分子量KGM 本身结构特性所决定的.由表1 还可以看出，随着振荡速率的提高，酶促KGM 乙酰化反应初始速率均逐渐加快. 底物KGM分子量较大时，酶促其乙酰化反应明显加快；底物KGM分子量较小（61 000 -10 800 ）时，振荡速率对酶促反应的加速作用不甚明显. 这说明在KGM 分子量较大时传质阻力较大，需要较强烈的振荡才能基本消除扩散限制.对于酶促KGM 酰化

12、反应，KGM 的颗粒形态也是一个非常重要的影响因素. 图1 为不同分子量的KGM 的扫描电镜照片. 可以看出，3 种不同分子量的KGM 颗粒结构差别较大. 随着KGM 分子量的减小，KGM 颗粒的平均粒径逐渐减小. 放大1 500 倍时，可以明显发现这3 种不同分子量的KGM 单颗粒的差别：图1（a/ ）中的KGM 颗粒表面密实、平滑，只有少量的隆起和较浅的刻痕；图1（b/ ）中的KGM 颗粒呈多孔不规则状，有大量突起，其结构明显比较疏松；图1（c/ ）中的KGM 则呈絮状，其结构更为疏松. 放大10 000 倍时可以更加清楚地看到，随着KGM 分子量的减小，表面变得粗糙、多孔，结构更疏松.

13、表面粗糙、多孔，有利于底物与酶的充分接触，增大碰撞几率，提高反应速率；结构疏松，有利于底物在溶剂中的分散和溶解，并降低扩散阻力. 另一方面，小分子量的KGM 作为底物时，进入酶活性中心的空间位阻较小.2.2 酰基供体对酶促KGM酰化反应(fnyng)的影响酰基供体脂肪酸碳链的长度亦影响酶促KGM酰化反应(fnyng). 一方面，随着脂肪酸乙烯酯碳链的加长，其疏水性增强，与酶活性中心的亲和力增大，有利于酶促酰化反应. 另一方面，脂肪酸乙烯酯碳链加长，空间位阻增大，不利于酶- 底物中间物的形成. 为了揭示酰基供体结构对酶促KGM 酰化反应的影响规律，合成具有不同理化性质和用途的KGM 酰化产物，对

14、比研究了酶促KGM 与一系列脂肪酸乙烯酯的酰化反应. 表2 为酰基供体对酶促KGM 酰化反应的影响. 可以看出，随着酰基部分的脂肪酸碳链的增长，NoVoZym435 催化KGM 酰化反应速率逐渐减慢，产物的DS 逐渐减小. 可见，随着酰基供体分子的增大，其空间位阻对该反应的影响起主导作用. Pedersen 等14 对NoVoZym 435 催化二糖（蔗糖和麦芽糖）合成糖酯的研究(ynji)表明，随着酰基供体脂肪酸碳链的增长（C4 -C12 ），酶促反应速率急剧下降；他们认为酰基供体碳原子数增加，空间位阻逐渐增大，是造成酶促反应速率减慢的主要因素.表二 酰基供体对酶促KGM酰化反应的影响Tab

15、le 2 Effect of acyl donors on li pase-catalyZed acylationof KGM（MW=77 000 ）Reaction conditions ：m（KGM）= 0. 4 g ，n（RCO2CHI CH2）= 7. 5 mmol ，m（NoVoZym435 ）=0. 24 g ，V（t- BUOH）=l0ml ，aW=0. 75 ，f=l50 rmi n ，!=50 C，t=48 h .2.3 酶促KGM酰化反应(fnyng)的区域选择性与化学方法相比，酶法的突出优点是其区域选择性高. 以特定位点修饰的多糖衍生物作为药物(yow)或进行分析，可确定

16、有机介质叔丁醇中酶促酰化反应的区域选择性. 表3 为KGM 和酰化的KGM 中碳原子的化学位移. 底物KGM 中葡萄糖残基或甘露糖残基各碳原子的归属根据文献16 确定.表3 KGM和酰化的KGM中碳原子的化学(huxu)位移由表3 可以看出，乙酰化的KGM 在化学位移21. 4 和172. 6 !170. 4 处出现两个新峰，分别被归属为乙酰基的H3C- 和C=O 中的碳原子. 这进一步证明了酰化反应的发生. 根据大量的碳谱数据(shj)建立的酰化反应前后碳原子化学位移的变化规律是：发生酰化反应的碳原子的化学位移向低场移动；受70. 9 . 综上所述，酶促KGM 乙酰化反应发生在C6-OH上.

17、 当以其他脂肪酸乙烯(y x)酯为酰基供体时，酶促KGM 酰化反应的区域选择性与乙酰化反应相同.结 论研究(ynji)了在有机介质叔丁醇中分子量及酰基供体对固定化脂肪酶Novozym435 催化KGM 乙酰化反应的影响. KGM 的分子量对酶促其酰化反应有显著的影响. 随着KGM 分子量的减小，酶促其酰化反应的活性逐渐升高. 以不同链长的脂肪酸乙烯酯为酰基供体时，随着酰基供体中脂肪酸碳链的增长，酶促KGM 酰化反应速率逐渐减慢，产物的取代度逐渐减小. 核磁共振分析表明，有机介质叔丁醇中酶促KGM 酰化反应具有高度的区域选择性，反应发生在C6- OH上.参考文献1 Kato K，Matsuda

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