临床检验技士-免疫学和免疫2017全1、讲义

1、第十章 化学发光免疫分析技术第一节 概述发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并发光等。光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为光照发光、生物发光、化学光照发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素。实际上，生物发光就是发生在生物体内的一种化学发光。一、化学发光化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化

2、学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式出能量，这一现象称为化学发光。二、化学发光效率化学发光反应的发光效率又称化学发光反应量子产率。化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。因此，可设计出不同的反应模式。第二节 化学发光剂和标记技术一、化学发光剂化学发光剂必须具备下列条件：发光的量子产率高；它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体

3、形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没化学发光免疫分析中所使用的标志物可分为两类性。（一）直接化学发光剂 直接用化学发光剂标记抗原或抗体。吖啶酯是目前常用的直接标记发光剂。吖啶酯 在碱性条件下被 H2O2 氧化时，发出波长为 470nm 的光，具有很高的发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。吖啶酯类发光剂可直接用于标记半抗原和蛋白质等。用于标记抗体时，结合稳定，结合后并不减少光量子的产生，可获得高的比活性，有利于双位点化学发光免疫分析的建立。三联吡啶钌 三联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时

4、失去一个电子而发生氧化反应。（二）酶促反应发光剂 利用标记酶（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）的催化作用，使发光剂（底物）发光。辣根过氧化物酶催化的发光剂为及其衍生物；碱性磷酸酶催化的发光底物为PD。二、发光剂的标记技术发光剂的标记是通过化学反应将发光剂联接到抗体或抗原上。（一）常用标记方法 小分子物质（如药物、激素等）的标记主要是通过偶联反应；生物大分子的标记是利用交联剂使标记物与被标记物分子结构中游离的氨基、硫氢基、羟基等基团形成不可逆的连接。常用的标记方法有：碳二亚胺缩合法过碘酸钠氧化法重氮盐偶联法4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法（二）影响标记的发光剂的选择。被标记蛋白质的性质：选用较高的纯度和

5、免疫学稳定性的抗原进行标记；抗体作为被标记物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的 IgG 来代替全3.选择正确的标记方法。原料比：IgG:发光剂:交联剂的克分子比（mol:mol:mol）会影响结合物的发光效率。标记率：结合物中 IgG 与发光剂之间的克分子比。温度：尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。纯化与保存：通过透析法、凝胶过滤法和盐析沉淀法等进行纯化。结合物一般可分装保存在-70条件下，最好冷冻干燥保存。第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫分析技术。CLIA 具有灵敏度高、特

6、异性强、无放射性危害等优点，已基本取代放射免疫分析应用于临床实验和医学研究工作中。一、直接化学发光免疫分析化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体（抗原），与待测标本发生免疫反应后，形成固相复合物，加入氧化剂（H2O2）和纠正液（NaOH）使呈碱性环境，吖啶酯分解、发光，时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。吖啶酯化学发光的特点：推动者发光的氧化反应简单快速，不需要催化剂，只要在碱性环境中即可进行；反应体系中加入 H2O2 和 NaOH 溶液后，发光迅速，背景噪声低，保证了测定的敏感性；吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的生物学

7、活性和理化特性；吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，因此，对信号检测仪的灵敏度要求比较高。二、化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。（一）辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（或抗原），与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入发光剂、H2O2

8、 和化学发光增强剂使其产生化学发光。（二）碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 该分析系统以碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入PD 发光剂，碱性磷酸酶使PD 脱去磷酸根基团而发光。化学发光酶免疫分析的特点：化学发光酶免疫分析属酶免疫测定范畴，测定过程与 ELISA 相似，仅最后一步酶反应的底物改为发光剂和测定的仪器为光信号检测仪；酶标记抗原或抗体结合稳定；酶催化、PD 等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于和测定。三、电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（ECLIA），磁性微粒为固相载体抗体（抗

9、原），以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。电化学发光免疫分析的特点如下：三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始地发光，持续时间长，信号强度高，容易测定，容易控制；三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响被标记物的理化特性；试剂灵敏度高，稳定性好。四、临床应用由于化学发光免疫测定技术无放射性污染，同时能达到放射免疫测定的灵敏度，而且还具有快速、准确、特异、可自动化等特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物浓度及其他微量生物活性物质的测定。【习题】（15 题共用）采用化学发光剂作为酶反应底物用化学发光剂直接标记抗原或抗体C.抗体在磁颗粒表面D.发光底物是二价的三联吡啶钌 E.以荧光物质标记抗体1.免疫荧光技术采用正确E免疫荧光技术采用以荧光物质标记抗体。2.电化学发光免疫技术采用正确D电化学发光免疫技术采用发光底物是二价的三联吡啶钌。3.化学发光免疫采用正确B化学发光免疫采用用化学发光剂直接标记抗原或抗体。4.化学发光酶免疫采用正确A化学发光酶免疫采用采用化学发光剂作为酶反应底物。关于化学发光免疫分