非那西丁药代动力学研究实验报告分析

1、 非那西丁的药代动力学研究实验报告概述：非那西丁（Phenacetin为一种解热镇痛药，因为潜在副作用在临床已基本不 使用。但由于其是 CYP1A2 酶的特异性底物，被广泛选择作为底物用于酶活性 测定实验以及影响酶活性作用药物的研究。本学期临床药代动学实验课以非那 西丁在大鼠体内的代谢实验、大鼠肝微粒体温孵实验两部分为例，通过实验设 计，实验操作，结果评价等一系列过程，系统地学习了药代动力学中药物体内 外的简单研究方法、实验数据的处理、以及相关药动学参数的计算与评价。正文1.非那西丁在大鼠体内的药代动力学研究1.1 实验目的研究非那西丁在大鼠体内代谢的药代动力学，学习大鼠眼底静脉丛取血等 操作

2、。1.2 实验材料与方法仪器：HPLC-UV&谱仪，高速冷冻离心机，涡旋振荡器；HPLCfe谱条件：检测波长：254nm色谱柱： inertsil-ODS-S,P5um,4.6*150mm 流速： 1.0ml/min柱温：40C流动相： 40（乙腈 ）： 60（50mM 磷酸盐缓冲液）（注：50mM磷酸盐缓冲液配制：6.8g磷酸二氢钾，加入150ml氢 氧化钠溶液（0.1M），配制成1L的磷酸盐缓冲液）试剂：非那西丁注射剂，对乙酰氨基酚标准品，肝素钠，10%高氯酸；实验动物 ：雄性大鼠， 180g220g1.3 实验步骤1.3.1 标准曲线的制备：取空白血浆，加入对乙酰氨基酚标准品，使其浓度分

3、别为 0.156,0.313,0.625,1.25,2.50,5.00,10.00ug/m。在给定的色谱条件 下进行HPLC分析，以样品的峰面积对样品浓度进行线性回归。1.3.2给药及血浆采集处理：取大鼠一只，尾静脉注射非那西丁（10mg/kg）后，分别于 0，5,10,15,30,45,60,90,120min于尾静脉取血0.5ml，肝素抗凝。离心取200ul血浆。向血浆中加入100ul 10%高氯酸，涡 旋振荡1min （转速为15000转/分钟），离心10min，取上清供HPLC分 析。1.4实验结果处理表1体内实验中对乙酰氨基酚标准曲线组别浓度(ug/ml)峰面积理论峰面积准确度10.

4、1561435919283(0.2554)20.3125439030.6253321936462(0.0889)41.2565033593550.095752.501067991051420.015865.002000671967140.0170710.00377336379859(0.0066)舍去第2组数据做图得对乙酰氨基酚的标准曲线（图1），用标准曲线的回归方程带入浓度计算标准曲线准确度（表1），可见除第1、2组数据外其他点基本符合准确度20%这一条件（考虑到样品定量范围且第一组数据准确度 基本接近20%，第1组数据不舍去），说明标准曲线有效，可用来计算定量样 品。图1体内实验对乙酰氨基

5、酚标准曲线以得到的标准曲线的回归方程计算以10mg/kg给药的大鼠血浆样本中的非那西丁的浓度得表2大鼠血浆样本中非那西丁的浓度组别取血时间/mi n峰面积浓度/(ug/ml)16.5504641.007210.5492830.975314.5421070.779429.5359930.61254513359-0.006注：第5组数据是有问题的，有可能与大鼠的死亡前代谢状态改变有 关系，故后续处理舍去第5组数据。静脉注射后非那西丁在大鼠体内的代谢符合一房室模型，以一房室模型拟 合得图2非那西丁 c-t 一房室拟合t/min根据拟合方程计算非那西丁的药动学参数，得co =1.1621ug/mlVd

6、=xo/ co=1O(mg/kg)/1.1621(ug/ml)=8.6OL/kgti/2=0.693/k=0.693/0.0223=31.08mi nCL=kVd=0.0223*8.60L/kg=0.192L/(mi n kg)AUC= x0/(kVd)=10(mg/kg)/0.192L/(min kg)=52.08mg/L min1.5讨论 标准曲线组数据为其他实验组同学数据，本组由于HPLC测定时仪器出 倒峰，未取得实验数据。取血点的设定：取血点应覆盖药物的吸收相、平衡相和消除相，一般设计在吸收相和平衡相各2-3个点，消除相内4-5个点。整个采样时间至少应为 3-5个半衰期，或采样持续至峰

7、浓度的 1/10-1/20。查文献得非那西丁静注后在 大鼠体内的半衰期一般为 0.5h 左右，故整个取血时间持续 1.5-2.5h 时较为合 理。3）色谱条件的设定：色谱条件的选择首先应保证测定物质能够良好的分 离，同时还应该考虑方法的可行性，需要的操作时间等因素。4）取血操作：应在取血前向 EP 管中加入适量肝素溶液，取入血液后立即 上下翻动 2-3 次使肝素与血液混合防止血液凝固，但不可用力过猛以免溶血影 响后续测定。5）数据分析：本组实验中，由于大鼠死亡，取得血浆样本的时间点较 少，故拟合曲线的偏差也比较大。因此虽然最后由此求得的t1/2 处于一般范围内，但因为数据较少，且为单只动物实验

8、，不排除结果的偶然性。2. 大鼠肝微粒体温孵实验2.1 实验目的了解肝微粒体及肝微粒体酶活性的评价方法 ,学习肝微粒体温孵液中对乙酰 氨基酚浓度测定方法的建立。2.2 实验材料与方法仪器 ：HPLC-UV 色谱仪（色谱条件同前）、高速冷冻离心机、涡旋振荡 器、恒温水浴锅；试剂：大鼠肝微粒蛋白溶液、NADPH再生系统（0.5mM NADP+、5mM MgCI、10mM G-6-P、1U G-6-P脱氢酶）、对乙酰氨基酚、非那西 丁、冰甲醇2.3 实验步骤231.标准曲线的配制：180uI大鼠空白肝微粒体，加入20uI不同浓度的对乙 酰氨基酚，配成对乙酰氨基酚浓度分别为 1.56、 3.12、 6

9、.25、 12.5、 25、 50、 100uM的一系列溶液，再加入100ul冰甲醇沉淀，涡旋2min,12000rpm,离心10min, 取上清，20ul进样分析。2.32温孵实验及样品处理：80ul大鼠肝微粒体溶液，分别加入80ul浓度依 次为6.25、12.5、25、50、100、200、400uM的非那西丁探针底物，37 C预温 孵5min后，再分别加入NADPH溶液40ul，于37 C温孵30min。加入100ul冰甲 醇沉淀，涡旋2min,12000rpm,离心10min,取上层有机相200ul，20ul进样分析2.4实验结果：表3温孵实验中对乙酰氨基酚标准曲线组别浓度（umol/

10、l）峰面积理论峰面积准确度11.5636694332(0.1531)23.1261337731(0.2067)36.251448814552(0.0044)412.528850281700.024152558782554080.0609650108154109883(0.0157)7100139879第7组数据偏差较大，舍去第7组数据后作图得标准曲线（图3）,用标准曲 线的回归方程带入浓度计算标准曲线准确度（表 3），第2组数据准确度20% , 但舍去第2组数据后，得到的标准曲线虽然 R2稍有提高（R2 =0.998）,但再次代 入计算准确度时另几组值准确度均有偏大倾向，且考虑到数据组数减少时

11、误差 变大，故保留第2组数据。图3温孵实验中对乙酰氨基酚标准曲线C(umol/L)用此标准曲线计算通过标准曲线计算出产物中对乙酰氨基酚浓度（表4），以非那西丁浓度和对乙酰氨基酚的生成速率，用双倒数作图法作图（图4），求得相关药代动力学参数。表4温孵实验中相关数值计算组别峰面积C-PARA(umol/l)C-PHE(umol/L)1/c-PHEv-(umol/h/tei n)1/v125911.17436.250.1611.74260.0852293404.232912.50.0842.32950.0236360352.7351250.0427.35100.03664162257.35

12、33500.0273.53270.013652747412.45141000.01124.51390.008063446215.61842000.005156.18400.006474374719.82644000.0025198.26420.0050第1组数据不在标准曲线定量范围内，第3组数据偏差过大，故舍去第1、3组数据，剩下5组数据以双倒数法作图。图4双倒数法作图1/c-PHEv250.0000200.0000150.0000100.000050.00000.0000图5底物浓度与反应物生成速率作图c-PHE由图4:km/vmax =0.2289 1/vmax =0.006进而，vmax

13、=166.67umol/h/gkm= 38.15umol/L求得的vmax为166.67 umol/h/g,但显然测得的实测数据中的 v最大值大于 此值，以底物浓度对反应速率作图（图5），也可看出曲线在最后一个点时仍呈上升趋势，也就是说在曲线范围内并未达vmax，结果存在偏差。图6双倒数法作图（2）0.01400.01200.01000.00800.00600.00400.00200.0000继续舍去表4中第2组数据进行双倒数回归，0.01601/v由图6：km/vmax =0.4832 1/vmax =0.0037进而，vmax=270.27umol/h/gkm= 130.59umol/L该

14、条件下求得的vmax虽然不在标准曲线定量范围内，但比较符合图5中的反应趋势，更接近反应的真实状态。2.5讨论：1）终止试剂的选择：酶反应实验中，终止试剂的选择非常重要，该类型实 验中一般可选的终止试剂有乙腈和冰甲醇等，有实验表明乙腈终止时易产生干 扰，故本实验选择了冰甲醇作为终止剂。2）数据分析：根据温孵实验结果的结果分析，实验中反应并未达到最大反 应速率。一般在酶促反应中，反应的速率取决于底物浓度、反应时间、酶活性等因素，本次实验中在实验条件下未达到vmax，可能是由于此次所用的肝微粒体酶活性活性较高，在所设定的底物浓度范围内酶仍未达到饱和，可以通过减 少肝微粒体酶的使用量，或者扩大底物浓度的设定范围来进行改善实验，使实 验结果更具有科学性。个人总结相较于往常的按照既定实验步骤操作的实验，本学期的实验需要实验者更 加注重细节与思考，探索实验中每一项设定的原因、合理性、以及不同的条件 设定对实验结果的影响，在此基础下，进行实验、处理结果时又更容易促发对 实验原理和过程的反思，从而对整个实验以及药代动实验的设计有了一个比较 深的认识。另外得到的一点教训是，实验过程中数据及相关信息的记录至关重 要，尤其是实验时间跨