(整理)酶工程实验3

1、精品文档实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。二、实验原理h2o2被过氧化氢酶分解出h2o和02，未分解的h2o2用kmno4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。H2O22H2O+0212KMNO4+5H2O+3H2SO42MnSO4+5O2+8H2O本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/v1/S作图求Km三、实验器材锥形瓶100150ml(X6)O吸管1.0ml(X2)、0.5ml(X2)、2.0ml(X2)、5ml(X2)、10.0ml(X1)。温度计(0100C)。微量滴定管5ml(X1)。容量瓶1000ml(X1)。

2、四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液(Ph70)取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml,即得。2、酶液：称取马铃薯5g,加上述缓冲液10ml,匀浆，过滤。3、0.02mol/LKMnO4:称取KMnO4(AR)32g,加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。4、0.004mol/LKMnO4:准确称取恒重草酸钠02g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65C，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

3、5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L）,用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml,加25%H2SO42.0ml,用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。6、25%H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定试剂管号0123450.05mol/LH2O2/ml01.001.251.672.55.00蒸馏水/ml9.58.508.257.837.04.50酶液/ml0.50.50.50.50.50.5先加好

4、0.05mol/LH2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的电02至微红色，记录消耗的KMnO4体积。六、计算分别求出各瓶的底物浓度S和反应速度V。S=c1V1/10C1V1C2V式中S：底物物质的量浓度（mol/L）；5：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；U:反应速度（mmol/min）；c:KMnO4物质的量浓度（mol/L）；24V2：KMnO4体积（ml）；以1/u对1/S作图求出Km。实验二酶促

5、反应中初速度时间范围测定一、实验目的了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶(acidphosphatase,EC3.1.3.2)广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯(4-nitrophenylphosphate,NPP)作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得

6、酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成mol产物所需的酶量。要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。三、实验

7、试剂与器材试剂(1)酸性磷酸酯酶原液(从绿豆芽中提取)(2)酸性磷酸酯酶液(通过原酶液稀释得到)取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A40在0.60.7之间。405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。（4）0.3mol/LNaOH溶液2器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。四、操作步骤酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h,在2530C温箱中培养57d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g放入研钵中匀浆，加0.

8、2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35C恒温水浴槽中预热2min。然后向111号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10m

9、in、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL0.3mol/LNaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mLNPP后保温25min，然后加入3.0mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A值。405数据处理以反应时间为横坐标，A值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部405分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。表1.1制作酶促反应进程曲线时各物质加入量试管号12345678910110NPP(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.0

10、1.01.01.01.0稀释酶液(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0反应时间(min)3571012152025304050250.3MNa0H(mL)3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.321.26),本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。(请参考相关教材)三、试剂与仪器1、试剂与材料：干酵母

11、石英砂1mol/L醋酸溶液2mol/L氢氧化钠溶液醋酸缓冲液(pH4.6)5%蔗糖溶液DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒移液管。四、操作方法1、破碎细胞取2g干酵母于研钵中，加入2g石英砂，加30ml去离子水，研磨15min，放入冰箱冷冻室(-20C)冰冻约20min(研磨液面上刚出现冰结为宜)。取出冷冻酵母，再研磨5min后，在5000r/min条件下离心12min，小心取出上清液(组分一)并量出体积V,分别取0.5ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶。2、纯化把三角瓶中的上清液用1mol/L醋酸溶液调pH5.

12、0（试纸）。然后迅速放入到55的水浴中，保温30min。之后在冰浴中迅速冷却。在5000r/min条件下离心12min。取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5ml上清液到试管C、D中。3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管编号酶液氢氧化钠溶液醋酸缓冲液蔗糖溶液A（对照管）0.5ml1ml1ml1mlB0.5ml2ml1mlC（对照管）0.5ml1ml1ml1mlD0.5ml2ml1ml试管中反应物在55C水浴中反应5min（秒表计时）后，B、D管立即各加入1ml氢氧化钠溶液（2mol/L）终止反应，A、C管中各加入1ml蒸馏水。4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物：

13、试管编号反应液DNS试齐U10.5mlA0.5ml20.5mlB0.5ml30.5mlC0.5ml40.5mlD0.5ml5（空白）0.5ml蒸馏水0.5ml试管中反应物在沸水浴中反应5min，然后冷却。加入4ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。五、结果计算1、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55C条件下，每1min催化底物转化为1mg还原糖的酶量。2、酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：(B-A)x5x5ABSABS454.5x-0.5纯化后酶的计算酶活（组分二）：(D-C)x5x5ABSABS454.5x-0.53、总酶活的计

14、算：（V总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活X稀释倍数厶10.5丿（V总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活X稀释倍数厶10.5丿4、酶活回收率的计算：酶活回收率=总酶活2总酶活1x100%附：还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原

15、糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定一、目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。二、原理：海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料（8）干酵母（9）海藻酸钠(10)无水氯化钙(11)5%蔗糖溶液(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉

16、、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。四、操作方法4、配A液取0.75g海藻酸钠溶在25ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。5、配B液取1g干酵母溶在25ml蒸馏水中（室温），搅匀。6、配C液A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。4、配CaCl2液取2.2g无水CaCl2溶于200ml蒸馏水中。5、制备胶珠用注射器（7号针头）将C液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20min,固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1）,并记录。6、催化取1g湿胶珠置于烧杯中，加入20ml5%蔗糖溶液，37C反应10min,取出

17、反应液，与胶珠分离，反应终止。7、酶催化产物检测将反应液定容至20ml，取0.5ml稀释至5ml，得D液。取2支试管，分别加入反应物：试管编号反应液DNS试齐U10.5mlD0.5ml2（空白）0.5ml蒸馏水0.5ml试管中反应物在沸水浴中反应5min，然后冷却。加入4ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液调零点，测定它们的吸光度值A540。五、结果计算5、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在37C条件下，每1min催化得到1mg还原糖所需酶量。Ax一x55404520 xx-100.50.56、酶活计算：1g固化酶酶活：六、思考题1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中C

18、a2+的作用有何关系？2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？其原理是什么？实验五尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤二、原理尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布(86或66),140目，剪成3cmX3cm2、仪器恒温水浴锅(2)紫外分光光度计(3)冰箱3、试剂18.6%CaCl2溶液(2)甲醇溶液(3)3.65mol/LHCl溶液0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5O.lmo

19、l/L磷酸缓冲液(pH值7.8)(7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8)0.5mol/LNaCl溶液(9)O.lmol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。10%三氯乙酸(TCA)溶液。四、操作步骤1、固定化酶的制备(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室

20、温下水解45min,用水洗至pH值中性(pH试纸检测)。将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。取出尼龙布，用O.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。2、酶活力测定0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液固定化酶一张(剪碎)+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白

21、液取三支试管按上述加入反应液，37C反应15min，A、C+2ml10%三氯乙酸。三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值(280nm，紫外)五、结果计算1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。2.酶活回收=固定化酶活x5溶液酶活x5/0.2x100%六、注意事项尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎固定化酶溶液浓度最好为0.51mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。酶活性测定的反应时间一定要准确。实验六、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的

22、菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。图1产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤2、试剂：RBV-Starch(Sigma),NaNO3,K2HPO4,MgSO4,KCl,2mol/LNaOH无菌水和琼脂粉等。3、器皿250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、20

23、0卩L移液枪、200卩L枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。四、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121C下灭菌20min，取出备用。2、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉(1.2%,w/v),NaNO3(0.2%,w/v),K2HPO4(0.2%,w/v),MgSO47H2O(0.1%,w/v),KC1(0.1%,w/v),琼脂(2%,w/v),调PH至6.0左右。在三角瓶中，121C灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。(倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。)3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。4、富集称取5.0g混合土样和0.5g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。5、菌种的初筛称取1.0g步骤4所得