红细胞计数血红蛋白测定的原理课件

1、目的要求1.掌握：红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义 ； 红细胞形态。2.了解：血红蛋白测定其他方法 。重点 :红细胞计数、血红蛋白测定的原理、血片 红细胞形态、难点:红细胞检验的形态、质控。目的要求一、概 述1.红细胞的生成骨髓造血干细胞-红系祖细胞-原红细胞-早幼-中幼-晚幼-网织红细胞-成熟红细胞Epo每个原红细胞可以生成16个红细胞。48h无分裂能力2.红细胞的破坏健康人红细胞平均寿命120天。红细胞主要因衰老而消亡，破坏主要在单核-巨噬细胞系统，器官主要是在脾脏和肝脏；其次为骨髓和其他部位。二、红细胞计数红细胞计数（red blood

2、 cell count,RBC）即测定单位体积内红细胞数量。是血液一般检验的基本项目，常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。测定方法显微镜计数法血液分析仪法（一）显微镜计数法【检测原理】 采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞数量。【器材】 微量吸管，采血针，小试管，计数板，盖片，棉球，显微镜。【试剂】红细胞稀释液：任选一种1.Hayem稀释液：氯化钠1.0g、硫酸钠（含10个结晶水）5.0g，氯化高汞0.5g，蒸馏水加至200mL，过滤后使用。氯化钠-调节渗透浓度 硫酸钠-提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞-防腐剂，

3、有毒2.柠檬酸盐甲醛盐水氯化钠 0.6g 调节渗透压柠檬酸钠 1.0g 调节渗透压，抗凝36%甲醛 1ml 防腐蒸馏水加至100ml，过滤2次后使用。3.生理盐水或加1%甲醛的生理盐水【操作】1.中号试管（15100mm）加等渗稀释液2ml；2.毛细血管采末梢血10l加入上述稀释液，立即摇匀（稀释200倍）；3.充池，静置2min后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央5个中方格内的红细胞数。未染色红细胞呈双凹盘形，有黄绿色折光。红细胞计数2ml稀释液 充分混匀 10ul血液 充池、静止 镜下计数 3mm WBC WBC WBC WBC 1mm红细胞数/L=5个中方格内红细胞5 10 200 10

4、6/L 或 = 1012/L5个中方格内红细胞数100【报告方式】【计算】RBC（/L）= . 1012/L【方法学评价】 1手工显微镜法 2血液分析仪法 为目前主要临床检验细胞计数方法变异系数（coefficient of variation, CV ）小。【质量控制】1手工法 误差来源包括：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差）2仪器法 严格按操作规程；定期作室内和室间质控。 【参考值】男性 : （4.00-5.50） 1012/L 女性 : （3.50-5.00） 1012/L新生儿:（6.00-7.00） 1012/L【校正】WBC100109/L时，需校正：实际红细胞/L=所数细胞

5、总数白细胞数（正常红细胞：白细胞=750：1, 可忽略白细胞的影响）【注意事项】1.采血及摇匀迅速，防止血液凝固；2.器械应防酸防碱且干燥；3.充池要摇匀；4.计数时，应识别酵母及白细胞。三、血红蛋白测定（一）血红蛋白的结构血红蛋白结构： 由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。Hb色素部分：亚铁血红素蛋白质部分：珠蛋白Fe 2+原卟啉空间结构：每个血红蛋白有4条珠蛋白肽链，每条肽链包裹1个亚铁血红素，形成具有四级空间结构的四聚体。 【分类】（每个珠蛋白分子含两条 链和两条非 链） 正常人：HbA （ 22） 占90% 成人主要血红蛋白； HbA2（ 22 ） 占2%-3% 成人次要血红蛋白 HbF （

6、 22 ） 占2%以下 胎儿主要血红蛋白生理情况下，99%Hb的铁呈Fe2+状态，称为还原血红蛋白，亚铁状态的Hb与氧结合称氧合血红蛋白（HbO2). 1%Hb的铁呈Fe3+状态，称为高铁血红蛋白（Hi）。Hb的合成受激素的调节：Epo和雄激素。注意事项：1. 如-链或-链合成障碍，使三种正常血红蛋白比例异常，即各型地中海贫血；如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白病 。 2.病理情况下可出现硫化血红蛋白（SHb）。（二）血红蛋白衍生物及其吸收光谱 1.氧合血红蛋白（oxyhemoglobin, HbO2）:Hb与O2结合时形成。2.还原血红蛋白（reduced hemoglobin

7、, Hbred）：未与O2结合时的Hb。3.高铁血红蛋白（hemiglo -bin, Hi）或正铁血红蛋白（methemoglobin, Mhb）: Fe 2+被氧化成Fe 3+。4.碳氧血红蛋白（HbCO）、硫化血红蛋白（SHb）：与O2结合的配位键被CO、S等占据。5.氰化高铁血红蛋白（HiCN）：Hi与CN-结合而成。波峰540nm，波谷504nm。正常情况下，血液中血红蛋白主要是HbO2和Hbred，以及少量HbCO和Hi。（三）血红蛋白测定方法手工法：HiCN法SLS-Hb法AHD575法HiN3法血液分析仪法1、氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法1）原理：在Hb转化液中，除SHb外

8、，Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与CN-结合，生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN），吸收峰为540nm，毫摩尔消光系数为44 Lmmol-1 cm -1 。因此根据标本的吸光度，即可求得血红蛋白总量（不含SHb）。2）器材：分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。3）试剂：血红蛋白转化液（文齐液）成分如下高铁氰化钾：使Hb转化成Hi氰化钾：使Hi形成HiCN无水磷酸二氢钾：防止混浊，调节pH值TritonX100:非离子型表面活性剂，加速溶血，缩短转化时间，防止因血浆蛋白改变引起的混浊。4）操作：a. 取指血20ul，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静置5分钟。 b. 用分光光

9、度计比色。波长540nm，以空白转化液调零，测定吸光度“A”。5）计算标准状态下的计算Hb（g/L）=A 251A 367.7其中，A为测得的吸光度，64458为Hb的分子量，251为测定时血液稀释倍数，44为HiCN的毫摩尔吸光系数，1000为换算成摩尔吸光系数。64458441000非标准状态下的计算：求换算常数K 标准液标定Hb液浓度 (标准值)K= - 本室测定标准液的“A” (测定值)标本Hb g/L = 标本测定值A 举例：用不同浓度的Hb的标准品：50，100，150，200g/L测得的吸光度分别为0.13, 0.27, 0.41和0.54 。则K值为K= = =371.75若测

10、定管吸光度为0.32，则测定管Hb浓度为Hb（g/L）=0.32371.75=118.96HbA50+100+150+2000.13+0.27+0.41+0.546)结果报告Hb g/L7)参考值成年男性：120-160 g/L 成年女性：110-150 g/L新生儿： 170-200 g/L贫血分级： 轻度：男性120g/L,女性110g/L 中度： 90g/L 重点： 60g/L 极重度：30109/L，重症黄疸，严重的血管内溶血等。2、方法学评价1）HiCN法：由国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐，并经WHO确认为血红蛋白测定的参考方法。优点：操作简单，结果稳定可靠，试剂容易保存 能

11、测定除SHb以外的所有血红蛋白，并易 于建立质控。缺点：不能测定SHb。 对HbCO转化太慢，需要100分钟。 高丙种球蛋白血症，变性Hb血症，高白细胞的血可出现混浊，按15g/L（pH7.27.5）甚至50g/L（pH6.76.9）加入氯化钠可防止，高浓度有核RBC引起的混浊不能防止。 KCN为剧毒，需妥善保存。2)SDS-Hb（十二烷基硫酸钠）法优点：试剂无毒，结果准确，重复性好缺点：SDS纯度难保证； 依赖HiCN法，间接得到结果； 试剂可破坏WBC，不能与WBC同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。3）叠氮高铁血红蛋白法（HiN3）优点：准确度、精密度较高缺点：试剂仍有毒性，HbCO转

12、化慢本法与HiCN法相似4）碱羟血红蛋白法（AHD575）优点：试剂简易，不含毒性，呈色稳定，准确性与精确性较高。缺点:波峰位于575nm处，溶液中碱性较高，不适用于自动检测，HbF不能转化。5）CTAB法优点：溶血性强且不破坏白细胞，适于血液分析仪检测。缺点：精密度、准确度略低。沙利法为传统血红蛋白测定法，已淘汰。6）血液分析仪法优点：简便、快速、多项。缺点：仪器型号不同，使用的溶血剂不同，形成的Hb衍生物不同。 某些溶血剂形成的Hb衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂的量及作用时间。 对具有抗溶血剂作用的疾病（肝病、低色素性贫血），溶血不完全而影响结果。 有些溶血剂内虽加入了KCN，但其

13、衍生物并非HiCN，而是氰化血红蛋白，仪器需经过HiCN标准液校正后，才能进行Hb测定。（四）Hb与RBC测定的临床意义参考值 RBC Hb男性 （4.05.5）1012/L 120160g/L女性 （3.55.0）1012/L 110150g/L新生儿 （6.07.0）1012/L 170200g/L70岁男性 94.2122.2g/L70岁女性 86.5111.8g/L（1）生理变化1）年龄与性别新生儿6个月2岁婴儿 ，生长发育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性贫血。老年人 ：对营养摄取、利用和造血功能减退，RBC、Hb比中青年人低。男性女性：雄激素2）精神因素：情绪波动，使肾上腺素增

14、多，RBC、Hb 3）气压：气压低（高山居民），红细胞代偿性4）长期多次献血者，红细胞代偿5）妊娠期 ：妊娠期血容量明显 ，引起血液稀释，Hb常在100g/L以下，生理性贫血。（2）病理变化1）RBC和Hb增多指单位容积血液中红细胞数值及血红蛋白含量高于正常值高限。 男性 Hb 170g/L 女性 Hb 160g/L RBC 6.01012/L RBC 5.51012/L相对性增多：由于大量失水、血浆量下降而使血液浓缩所致，如呕吐、严重腹泻、大面积烧伤等。绝对性增多：见于慢性心肺疾病，真性红细胞增多症。2）红细胞和Hb减少：贫血骨髓造血功能低下：如再障、白血病、恶性肿瘤造血原料缺乏：如缺铁、叶

15、酸、VB12等；红细胞破坏增加：如各种溶血性贫血；红细胞丢失过多：如急、慢性失血；促红细胞生成素减低症（肾性贫血）Hb测定与红细胞计数的临床意义相似，但对贫血程度判断的准确性优于红细胞计数。Hb含量与RBC数量的关系 红细胞与血红蛋白的增减不一定成比例，如大细胞性贫血患者的RBC往往较Hb减少显著；而小细胞性贫血患者则相反。正色素性贫血：RBC、Hb成正比减少低色素性贫血：RBC Hb四、红细胞的形态检查概述各种原因可作用于红细胞生理进程的不同阶段，从而引起红细胞相应的病理变化，导致某些类型贫血的红细胞发生形态学变化，这些变化包括红细胞的大小、形状、染色性质和内含物的异常，因此RBC形态检查常

16、作为追踪贫血线索的一项重要检查内容，对贫血的诊断和鉴别诊断有重要的临床价值。【方法及评价】1.显微镜分析法：是仪器法校准的参考方法；2.计算机图像分析：能快速自动以正常红细胞形态为参考，按红细胞形态特征做出类型和比例统计分析，可用于RBC形态变化相关疾病的辅助诊断；3.血液分析仪法：不能直接提供红细胞形态改变的确切信息，需用镜检血涂片核实。注意：如果血片制作不良和染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。【质量控制】 选择细胞分布均匀的区域：红细胞堆积棒状穿钱状：细胞过于密集。但如果在血涂片较薄的区域出现，可能是红细胞外附有异型球蛋白注意完整的检查顺序。减少人为因素影响。人为原因造成红

17、细胞形态异常1.涂片不当：出现棘形红细胞、邹缩RBC、红细胞缗钱状形成等。2.使用非疏水性玻片：口型RBC。3.染色不当：嗜多色RBC。4.抗凝剂EDTA过高，或长时间放置血液：锯齿状RBC。5.涂片干燥过慢，或由于固定液中混有少许水分:面包圈形RBC。6.涂片末端附近：长轴方向一致的假椭圆形RBC。（一）正常红细胞形态（染色后）红细胞直径6.77.7um,平均直径为7.2um。桔红色，向心性淡染，中心苍白，淡染区约为红细胞直径的1/3。意义：正常人、再障、白血病、急性失血可见正常形态。（二）大小异常1. 红细胞大小不均（anisocytosis） 红细胞直径相差一倍以上，常见于各种重症增 生

18、性贫血，尤其见于重症巨幼细胞贫血。2.小红细胞（microcyte） 直径小于6um者称为小红细胞，正常人偶见。提示血红蛋白合成障碍，可能由于缺铁和珠蛋白代谢异常所致。见于缺铁性贫血和珠蛋白生成障碍性贫血。常伴有中心浅染区扩大。3.大红细胞（macrocyte） 直径大于10um，见于溶血性贫血（由于不全成熟的红细胞增多）及巨幼红细胞性贫血（是由于叶酸或维生素B12缺乏，DNA合成障碍，血红蛋白合成过剩，脱核后形成大红细胞或巨红细胞）。红细胞大小不一红细胞大小不一4.巨红细胞（megalocyte）直径大于15um，见于巨幼细胞贫血。细胞中心浅染区消失。 小细胞低色素多（缺铁、地贫） 单纯小红

19、细胞microcytemegalocyte溶贫、急性失血、巨幼贫Macrocyte巨幼贫anisocytosis低色素性贫血、溶贫、失贫、巨幼贫等增生性贫血。（三）形态异常1. 球形红细胞（spherocyte） 球形红细胞直径小于正常，厚度增加常大于2um，无中心浅染区，似球形。常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病及红细胞酶缺陷所致溶血性贫血等。2.椭圆形红细胞（elliptocyte）椭圆形红细胞呈卵圆形、杆形，长度可大于宽度3-4倍，是细胞膜缺陷所致，在遗传形椭圆形红细胞增多症病人血涂片中此细胞可在25%以上。 3.靶形红细胞（target cell） 中心区

20、和细胞周缘染色深，其间为不染色的苍白环。是由于H b含量不足而且分布不均。见于低色素性贫血，尤其是珠蛋白生成障碍性贫血。4.棘形红细胞（acanthocyte） 红细胞表面有刺状突起，大小不一、形态各异。 常见于遗传性脂蛋白缺乏症及脾切除、酒精中毒性肝病、尿毒症。5.镰形红细胞（sickle cell） 红细胞形如镰刀状，由于红细胞内存在HbS所致。主要见于镰形红细胞性贫血。6.口形红细胞（stomatocyte） 红细胞中心苍白区呈扁平状，形如一个微张开的鱼口。DIC及酒精中毒时可见少量此类细胞。7.裂片细胞（schistocyte） 为红细胞破坏后的碎片，大小不一，形态各异，边缘不规则。在微血管病性溶血性贫血如DIC时此类细胞增多。8.红细胞形态不齐（poikilocytosis）: 红细胞形态发生多种明显该变，可呈梨形、泪滴形、新月形、三角形等。最常见于巨幼贫。（四）染色异常1. 低色素性（hypochromatic）红细胞：血红