免疫学检验chap第七章荧光免疫技术

1、第七章 荧光免疫技术(Chapter 7 Fluoroimmunoassay)课程承担：济宁医学院免疫学教研室课件制作：医学免疫学省级教学团队主 讲 人：马 群授课班级：2010级医学检验本科授课时间：2013年9月10日临床免疫学检验 荧光免疫技术：是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫标记技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。第七章 荧光免疫技术fluorescence antibody technique, FATfluorescence immunoassay 荧光：荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释

2、放出能量，这种发射光称为荧光。第七章 荧光免疫技术 荧光：荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。常用荧光物质： 异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 藻红蛋白（PE）第七章 荧光免疫技术 荧光抗体：是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与特异性的高亲和力单克隆抗体通过化学共价键的方法结合而成。保存： 小量分装、避光、4（半年）、-20（23年）、稀释后4可保存13天。第七章 荧光免疫技术 荧光免疫组织化学技术：即荧光抗体技术、荧光显微镜技术，采用荧光素标记抗体与标本片中组织或细

3、胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位监测或对自身抗体进行定性和滴度测定。第一节 荧光免疫组织化学技术(Section 1 Fluorescence Immunohistochemistry Technique)一、基本原理（一）直接法第一节 荧光免疫组织化学技术简便快速特异性强一种荧光抗体只能检测一种抗原敏感度不如间接法一、基本原理（一）直接法第一节 荧光免疫组织化学技术一、基本原理（二）间接法第一节 荧光免疫组织化学技术一、基本原理（三）双标记法第一节 荧光免疫组织化学技术设立严格的实验对照正确区分特异性染色

4、和非特异性染色显色分布、深浅为判断依据二、结果判断第一节 荧光免疫组织化学技术二、结果判断第一节 荧光免疫组织化学技术第二节 荧光免疫分析(Section 2 Fluorescence Immunoassay) 荧光免疫分析是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪测定抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。时间分辨荧光免疫测定荧光偏振免疫测定荧光酶免疫测定 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。一、时间分辨荧光免疫测定灵敏度高发光稳定荧光寿命长自然荧光干扰少标

5、准曲线范围宽第二节 荧光免疫分析（一）基本原理1时间分辨自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长: 10s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析（一）基本原理2Stokes位移一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，容易分开。（一）基本原理3发射光谱和激发光谱一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析发射光谱带较窄：613nm10nm，干扰少（生物制品的本底荧光波长350600nm） 激发光谱带较宽：300nm350nm，利于增加激发能，提

6、高灵敏度。一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析（二）标记物和标记方法 镧系元素铕(Eu3+)铽(Tb3+)钐(Sm3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析（三）方法类型双抗体夹心法一、时间分辨荧光免疫测定第二节 荧光免疫分析（三）方法评价灵敏

7、度高：最小检出值达10-18mol/L分析范围宽：45个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化无放射性污染第二节 荧光免疫分析二、荧光偏振免疫测定 荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子抗原物质的含量。 荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，该荧光强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。（一）基本原理光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(525550nm)偏振光(485nm)荧光物质第二节 荧光免疫分析二、荧光偏振免疫测定AgF分子小，转动速度快

8、，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比（一）基本原理第二节 荧光免疫分析二、荧光偏振免疫测定（二）方法评价第二节 荧光免疫分析二、荧光偏振免疫测定 样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 快速，易自动化，重复性好 适于小分子物质检测 灵敏度低于非均相荧光免疫测定法第二节 荧光免疫分析三、荧光酶免疫测定 荧光酶免疫测定是利用酶标记抗体（或抗原）与待测抗原（或抗体）反应，借助酶催化荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。第二节 荧光免疫分析三、

9、荧光酶免疫测定（一）基本原理 标记酶：碱性磷酸酶（ALP） 底物：4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP） 产物：4-甲基伞形酮（4-MU） 照射：4-MU经360nm激发光照射，可发出450nm的荧光，荧光测定仪测定其强度。第二节 荧光免疫分析三、荧光酶免疫测定（二）方法类型双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法第二节 荧光免疫分析三、荧光酶免疫测定（三）方法评价 综合了酶免疫测定的放大效应和荧光测定的高敏感性 固相荧光酶免疫测定法效果好第三节 荧光免疫技术的应用(Section 3 Application of Fluoroimmunoassay)（一）病原体检测疾病诊断、流行病学调查、临床回顾诊断。（二）自身抗体检测辅助诊断自身免疫性疾病。抗核抗体(均质型)抗核抗体(斑点型)抗核抗体(核膜型)第三节 荧光免疫技术的应用（三）免疫病理检测组织中Ig、C、IC的检测，和肿瘤相关抗原的鉴定。肿瘤（人肝癌细胞）第三节 荧光免疫技术的应用（四）细胞表面抗原和受体检测淋巴细胞及其亚群的鉴定。第三节 荧光免疫技术的应用（四）细胞表面抗原和