双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接ppt课件

1、双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目的基因序列的分析教 师：程 琳2021 年 11 月分子生物学实验1实 验 目 的1、经过本实验了解双脱氧链终止法的根本原理，掌握DNA测序的根本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。2 DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。A. 双脱氧链终止法the chain termination method，是经过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B. 化学降解法chemical degradation method，是将双链DNA分子用化学试剂处置，产生切口，用同位素标志进展测序。一、DNA测

2、序的方法31. Sanger双脱氧链终止法测序原理 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。4根本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不可以区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3-末端。由于ddNTP 3不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。562、详细操作： 测序时分成四个反响, 每个反响除上述成分外分别参与2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸称为ddATP, ddCTP,ddGTP

3、, ddTTP, 然后进展聚合反响。在第一个反响中, ddATP会随机地替代dATP参与反响，一旦ddATP参与了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反响中所产生的DNA链都是到A就终止了。7 同理第二个反响产生的都是以C结尾的; 第三个反响的都以G结尾, 第四个反响的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了.8 假设有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反响中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的能够是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个假设参

4、与反响的是ddATP那么终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否那么继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 假设是ddATP掺入, 那么产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否那么可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT9 制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进展电泳，每组制品中的各个组分将按其链长

5、的不同得到分别，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。 即可得到测序结果：为GATCCGAT10制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 参与DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别参与少量4种双脱氧核苷酸 将4种反响产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 3、技术道路：114、 高通量自动化测序 DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反响的自动化，另一方面是指“读片过程的自动化。 自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双脱氧链终止DNA测序法的根本原理开展起来的。12自动化测序原理 自动化测序类似于PCR反响

6、，但只用一条引物，反响混合物中含有不同荧光标志的ddNTP与4种dNTP。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板；模板用量少，不用克隆；可实现高通量自动化。13高速自动DNA测序仪的构造及任务原理 由激光发射器产生的激光束，经过精细的光学系统后被导向凝胶外表的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的DNA片段发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光经过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标志波长区别开来。经成像透像

7、最后由高灵敏度的相机分段搜集信号，传送给计算所分析处置。14 荧光化合物标志链终止法以荧光颜色为标志信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反响在一个试管中进展；当新合成的终止单链经过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。1516Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序才干： 手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约1200 bp。17二、序列比对分析1. 类似性与同源性类似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系，比如部分一样或类似的百分比或其它一些适宜的度量。比如说，A序列和B序列的类似性是80，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进展本身部分比较。

8、18同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判别。就是说A和B的关系上，只需是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80都是不科学的。19 序列的类似性和序列的同源性有一定的关系，普通来说序列间的类似性越高的话，它们是同源序列的能够性就更高，所以经常可以经过序列的类似性来推测序列能否同源。 正由于存在这样的关系，很多时候对序列的类似性和同源性就没有做很明显的区分，呵斥经常等价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源性为80一说。20 序列类似性比较： 就是将待研讨序列与DNA或蛋白质序列库进展比较，用于确定该序列的

9、生物属性，也就是找出与此序列类似的知序列是什么。完成这一任务只需求运用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；21 序列同源性分析： 是将待研讨序列参与到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进展多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是实际分析方法中最关键的一步。完成这一任务必需运用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTAL等；222. Blast简介及运用1Blast简介 BLAST 是由美国国立生物技术信息中心NCBI开发的一个基于序列类似性的数据库搜索程序。 BLAST是“部分类似性根本查询工 具Basic Local Alignment Search

10、 Tool的缩写。23 Blast 是一个序列类似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择blastn程序。 下表列出了主要的blast程序：24主要的blast程序程序名查询序列数据库搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列Blastx核酸蛋白质核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译后的蛋白质序列逐一比

11、对。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一进行比对。252 Blast资源1、NCBI主站点：/BLAST/网络版/blast/ 单机版2、其他站点：/blast/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/果蝇 26 Blast结果会列出跟查询序列类似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息： 1.查询序列能够具有某种功能； 2.查询序列能够是来源于某个物种； 3.查询序列能够是某种功能基因的同源基因； 这些信息都可以运用到后续分析中。 273Blast运用登陆n

12、cbi的blast主页核酸序列蛋白序列翻译序列底下有其他一些针对特殊数据库的和查看以往的比对结果等28Blast义务提交表单11.序列信息部分填入查询query的序列序列范围默许全部选择搜索数据库假设接受其他参数默许设置，点击开场搜索29Blast义务提交表单2设置搜索的范围，entrez关键词，或者选择特定物种2.设置各种参数部分一些过滤选项，包括简单反复序列，人类基因组中的反复序列E值上限窗口大小假设他对blast的命令行选项熟习的话，可以在这里参与更多的参数30Blast义务提交表单33.设置结果输出显示格式选择需求显示的选项以及显示的文件格式显示数目Alignment的显示方式挑选结果

13、E值范围其他一些显示格式参数点击开场搜索31提交义务前往查询号requestid可以修正显示结果格式修正完显示格式后点击进入结果界面32结果页面1图形表示结果33结果页面2目的序列描画部分带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列匹配情况，分值，e值34结果页面3详细的比对上的序列的陈列情况354一个例子假设以下为一未知蛋白序列query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLG

14、TGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我们经过blast搜索来获取一些这个序列的信息。36详细步骤：1.登陆blast主页 /BLAST/2.根据数据类型，选择适宜的程序3.填写表单信息4.提交义务5.查看和分析结果371.登陆ncbi的blast主页2.选择程序，由于查询序列是蛋白序列可以选择blastp，点击进入也可以选择tblastn作为演示，我们这里选blastp383.填入序列copypasteFasta格式，或者纯序列4.选择搜索区域，这里我们要搜