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文档简介

1、实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体色素又称光合色素,在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类,前者包括 叶绿素a (蓝绿色)和叶绿素b (黄绿色),后者包括胡萝卜素(橙色)和叶黄素(黄色), 它们与类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体,不溶于水,易溶于酯,因此可用丙 酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。叶绿体色素的分离有多种方法,本实验仅介绍纸层 析法。层析的基本原理:在分离过程中,由一种流动相(即一种液体或气体)带动着试样经 过固定相(一种支持物,如纸)向外扩散,由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样 中不同成分的吸附程度有别,当用适当的溶剂推动时,混合

2、物中各成分在两相间具有不同的 分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,可使试样中的各种组分得到分 离,在做纸层析时,由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同,以及这些色素分子 在溶剂四氯化碳(推进剂)中溶解度也有差异,以致溶剂带动色素分子向四周移动时,各种 色素分子沿纸扩散的速度也就不同,使混合色素分离,出现不同颜色的环。将提取的叶绿素 溶液置于光下,在透射光呈绿色,在反射光下呈樱桃红色,这种现象称为荧光现象。在反 射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色,是因为叶绿色分子吸收光能后处于激发状态,激发 态的叶绿素分子很不稳定,当它回到基态时,将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量

3、子。叶绿素的化学性质很不稳定,容易受强光、高温等的破坏,特别是当叶绿素与蛋白质分 离以后,破坏更快,而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去 镁叶绿素,后者遇铜后,其中的氢(H+)又被铜(Cu2 + )取代,形成了铜代叶绿素,便 由褐色转变成蓝绿色,铜代叶绿素很稳定,且比原来的绿色还要稳定些,在光下也不易被破 坏。【材料、设备与试剂】1.材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。2.设备电 子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤 纸、小漏斗等。3.试剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙 等。【方法与

4、步骤】1.叶绿体色素的提取1.1取菠菜或其他植物新鲜叶片5?g,洗净,擦 干,去掉主脉后剪碎,放入研钵中。1.2在研钵中加入少量碳酸钙和约3-5?mL丙酮后,研 磨成匀浆,研磨过程中根据情况加入一定量的丙酮以利于研磨,匀浆用多层纱布过滤到试管 中。1.3在残渣中再加入35?mL丙酮,研磨过滤,共得深绿色溶液近10?mL,其中含有 叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质。2.叶绿体色素的分离 2.1纸层析分离法纸层析装置如图8.1所示。具体操作为:2.1.1先用滤 纸条(2?cmX4?cm)沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。2.1.2取 一张圆形层析滤纸(直径11?cm,略大于培

5、养皿直径),在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆 形小孔(滤纸不能折叠),将卷好的纸芯一端插入孔内少许,并剪去纸芯上端多余部分,使 纸芯上端与滤纸恰好平齐,下端长约1.5?cm (与培养皿盖高度同)。2.1.3把这个带纸芯 的圆形滤纸,平放在干净的培养皿上,用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液,小 心地滴入纸芯上端7-10滴。注意:一定要在色素斑点稍风干后,再滴入另一滴,而且液滴 不能污染滤纸。2.1.4向培养皿中倒入适量(约为培养皿高度的1/3左右)四氯化碳,并加 入一勺(适量)的无水硫酸钠,使纸芯下端浸入其中,并立即盖上培养皿。此时,推动剂借 毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上,并把叶绿体色

6、素向四周推动,数分钟后,就可见到滤 纸上出现四或五个颜色不同的同心环,并逐渐扩大。2.1.5当推动剂前沿接近滤纸边缘时(约 30?min左右),取出滤纸,即可看到分离的各种色素,用 铅笔 标出各种色素的位置和名称, 并绘简图示之或拍摄图片。3,叶绿体色素的理化性质3.1荧光现象观察叶片丙酮提取液(稀 释前的浓提取液)在反射光和透射光下的颜色有何不同并拍摄图片。叶绿体色素溶液在反射 光下呈樱桃红色,在透射光下呈绿色,说明原因。3.2光对叶绿素的破坏作用取叶绿体色素 提取液少许,分装于2支试管中,一支放在黑暗处(或用黑纸遮光);另一支放在强光下(阳 光直射),经0.51?h后,观察2支试管中溶液颜

7、色有何不同并拍摄图片。3.3氢和铜对叶 绿素中镁的取代作用3.3.1取2个试管,A管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL, 作为对照;在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入12具体操作为:2.1.1先 用滤 纸条(2?cmX4?cm)沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。2.1.2取一张圆形层析滤纸(直 径11?cm,略大于培养皿直径),在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔(滤纸不能折叠), 将卷好的纸芯一端插入孔内少许,并剪去纸芯上端多余部分,使纸芯上端与滤纸恰好平齐, 下端长约1.5?cm (与培养皿盖高度同)。2.1.3把这 个 带纸芯的圆形滤纸,平放在干净的 培养皿上,用细玻璃滴

8、管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液,小心地滴入纸芯上端滴浓盐酸, 摇 匀,溶液变为褐色,拍摄图片,此时叶绿素中的镁(Mg2+)被氢(H+)取代而生成 了去镁叶绿素。3.3.2从B管中分出一半装人C管,作为对照,在B管余下的溶液中加 入一小粒醋酸铜结晶,将B管和C管都在酒精灯上慢慢加热,则B管中的溶液又转变在 蓝绿色,拍摄图片,这是因为其中的氢(H+)又被铜(Cu2+ )取代,形成了铜代叶绿素。以叶绿素a为例,反应过程如下:/COOCH 壬 Cg 9 HjQNMgCOOC找 H39+狷十;一 Ml- xCOOCHg+ Mg”J 计叶绿素a(绿色)去镁叶嫌素(揭色)/COOCHa十COOCHjCgQ

9、M诚t徂COOC20Hj9COO&H 如去镁叶绿素(褐色)k: -J钢代叶绿漱(蓝墩色J【注意事项】(1)研磨叶片要充分,否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀,荧光现象不明显。(2)纸层析时,纸芯一定要卷实,分离色素用的圆形滤纸在中心打的小圆孔周围必须整齐, 否则分离的色素不是一个同心圆。(3)色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行, 以防止光破坏色素,影响实验结果。(4)实验用的有机溶剂较多,且都易挥发,取时动作要 快、取后要随时加盖。3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用3.3.1取2个试管,A管中加入 稀释后的叶绿体色素提取液2?mL,作为对照;在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液 5?mL并加入12【思考题】(1)图示叶绿体色素纸层析结果,用铅 笔分别标出叶绿

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