实验三 叶绿体色素的提取

1、实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括 叶绿素a （蓝绿色）和叶绿素b （黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色）， 它们与类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙 酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。叶绿体色素的分离有多种方法，本实验仅介绍纸层 析法。层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动着试样经 过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样 中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合

2、物中各成分在两相间具有不同的 分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分 离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同，以及这些色素分子 在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四周移动时，各种 色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色的环。将提取的叶绿素 溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，这种现象称为荧光现象。在反 射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激发状态，激发 态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量

3、子。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分 离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去 镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H+）又被铜（Cu2 + ）取代，形成了铜代叶绿素，便 由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破 坏。【材料、设备与试剂】1.材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。2.设备电 子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤 纸、小漏斗等。3.试剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙 等。【方法与

4、步骤】1.叶绿体色素的提取1.1取菠菜或其他植物新鲜叶片5?g，洗净，擦 干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。1.2在研钵中加入少量碳酸钙和约3-5?mL丙酮后，研 磨成匀浆，研磨过程中根据情况加入一定量的丙酮以利于研磨，匀浆用多层纱布过滤到试管 中。1.3在残渣中再加入35?mL丙酮，研磨过滤，共得深绿色溶液近10?mL，其中含有 叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质。2.叶绿体色素的分离 2.1纸层析分离法纸层析装置如图8.1所示。具体操作为：2.1.1先用滤 纸条（2?cmX4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。2.1.2取 一张圆形层析滤纸（直径11?cm，略大于培

5、养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆 形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使 纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约1.5?cm （与培养皿盖高度同）。2.1.3把这个带纸芯 的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小 心地滴入纸芯上端7-10滴。注意：一定要在色素斑点稍风干后，再滴入另一滴，而且液滴 不能污染滤纸。2.1.4向培养皿中倒入适量（约为培养皿高度的1/3左右）四氯化碳，并加 入一勺（适量）的无水硫酸钠，使纸芯下端浸入其中，并立即盖上培养皿。此时，推动剂借 毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色

6、素向四周推动，数分钟后，就可见到滤 纸上出现四或五个颜色不同的同心环，并逐渐扩大。2.1.5当推动剂前沿接近滤纸边缘时（约 30?min左右），取出滤纸，即可看到分离的各种色素，用 铅笔 标出各种色素的位置和名称， 并绘简图示之或拍摄图片。3,叶绿体色素的理化性质3.1荧光现象观察叶片丙酮提取液（稀 释前的浓提取液）在反射光和透射光下的颜色有何不同并拍摄图片。叶绿体色素溶液在反射 光下呈樱桃红色，在透射光下呈绿色，说明原因。3.2光对叶绿素的破坏作用取叶绿体色素 提取液少许，分装于2支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸遮光）；另一支放在强光下（阳 光直射），经0.51?h后，观察2支试管中溶液颜

7、色有何不同并拍摄图片。3.3氢和铜对叶 绿素中镁的取代作用3.3.1取2个试管，A管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL， 作为对照;在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入12具体操作为：2.1.1先 用滤 纸条（2?cmX4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。2.1.2取一张圆形层析滤纸（直 径11?cm，略大于培养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠）， 将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐， 下端长约1.5?cm （与培养皿盖高度同）。2.1.3把这 个 带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的 培养皿上，用细玻璃滴

8、管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端滴浓盐酸， 摇 匀，溶液变为褐色，拍摄图片，此时叶绿素中的镁（Mg2+）被氢（H+）取代而生成 了去镁叶绿素。3.3.2从B管中分出一半装人C管，作为对照，在B管余下的溶液中加 入一小粒醋酸铜结晶，将B管和C管都在酒精灯上慢慢加热，则B管中的溶液又转变在 蓝绿色，拍摄图片，这是因为其中的氢（H+）又被铜（Cu2+ ）取代，形成了铜代叶绿素。以叶绿素a为例，反应过程如下:/COOCH 壬 Cg 9 HjQNMgCOOC找 H39+狷十;一 Ml- xCOOCHg+ Mg”J 计叶绿素a（绿色）去镁叶嫌素（揭色）/COOCHa十COOCHjCgQ

9、M诚t徂COOC20Hj9COO&H 如去镁叶绿素（褐色）k: -J钢代叶绿漱（蓝墩色J【注意事项】（1）研磨叶片要充分，否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显。（2）纸层析时，纸芯一定要卷实，分离色素用的圆形滤纸在中心打的小圆孔周围必须整齐， 否则分离的色素不是一个同心圆。（3）色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行， 以防止光破坏色素，影响实验结果。（4）实验用的有机溶剂较多，且都易挥发，取时动作要 快、取后要随时加盖。3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用3.3.1取2个试管，A管中加入 稀释后的叶绿体色素提取液2?mL，作为对照；在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液 5?mL并加入12【思考题】（1）图示叶绿体色素纸层析结果，用铅 笔分别标出叶绿