细胞死亡检测和生物学意义

1、细胞死亡检测和生物学意义概述细胞死亡是生命体的重要生命活动之一；细胞的死亡与新生之间的动态平衡对于维持组织和器官的正常功能、保持机体内环境平衡和稳定具有重要作用；细胞死亡调控的异常可导致肿瘤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病的发生。概述根据形态学特征，三种重要的细胞死亡方式：apoptosis/凋亡autophagic cell death/自噬性细胞死亡necrosis/坏死The Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD)Cell Death and Differentiation (2009) 16, 311细胞凋亡Apoptosis细

2、胞凋亡概念的形成1972年Kerr和Wyllie正式提出细胞凋亡 （apoptosis） 的概念 apoptosis源于希腊语，apo意为from， ptosis意为fall，用于描述花儿凋谢、树叶落下的自然景色。这里用来描述以染色质凝聚、核固缩、细胞皱缩、细胞膜发泡等为特征的细胞死亡。 (Br J Cancer. 26: 239257, 1972)细胞凋亡概念的形成细胞凋亡深入到基因水平的研究起始于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Sydney Brenner, John E. Sulston系统研究了线虫整个发育过程中的细胞分裂和分化，于1998年完成了线虫的基因

3、组测序工作。1970-1980年间，美国科学家Robert H. Horvitz 研究了线虫细胞凋亡过程中的基因调控机制。三位科学家获得2002年生理和医学诺贝尔奖。罗伯特-霍维茨 悉尼-布雷内 约翰-苏尔斯顿细胞凋亡的概念细胞在凋亡因子的刺激下发生的一种由基因调控的、主动的程序性死亡；具有独特的形态学和生物化学特征一、细胞凋亡的形态学特征1. 凋亡的起始阶段： 细胞变圆,伪足收缩； 细胞质、细胞核体积缩小（固缩）； 细胞器多无明显变化 核染色质密度增高,凝聚在核膜周边（边缘化），呈新月形。一、细胞凋亡的形态学特征2. 凋亡小体的形成：核仁裂解，核染色质断裂，细胞膜内陷将细胞进行分割;细胞表面

4、产生许多泡状或芽状突起;形成单个的凋亡小体（apoptotic body）。一、细胞凋亡的形态学特征3. 凋亡小体被邻近的细胞吞噬并消化NATURE CELL BIOLOGY | VOL 2 | JUNE 2000,E1042 细胞呈现沸腾运动，细胞膜发泡3 凋亡小体 形成5 单核巨噬细胞吞噬1 细胞体积变小，染色质凝集，周边化，呈新月形4 上皮细胞吞噬 一、细胞凋亡的形态学特征细胞坏死的形态学特征 膜通透性增加；细胞质、细胞器肿胀（线粒体肿胀）；溶酶体破坏；细胞膜破裂；核染色质不规则位移； 引起严重的炎症反应； 成群细胞丢失； 最终被巨噬细胞吞噬。 细 胞 凋 亡 细 胞 坏 死1.单个细胞

5、丢失 细胞成群丢失2.细胞膜发泡但仍完整 细胞膜不完整3.细胞膜内陷将细胞 细胞肿胀、溶解 分割成凋亡小体 4.不发生炎症反应 发生严重炎症反应5.被邻近正常细胞 被巨噬细胞所吞噬或吞噬细胞所吞噬6.溶酶体完整 溶酶体裂解7.染色质均一凝集 染色质聚集成块、不均一细胞凋亡与坏死在形态学上的差别A 坏死细胞B 凋亡细胞细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的区别3. SEM of a necrotic cell. Numerous lesions appear on the cell surface. 4. SEM of an apoptotic cell. Surface blebbing is evi

6、dent. 细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的区别二、细胞凋亡的生物化学特征胞膜: 磷脂酰丝氨酸（PS）由膜内侧翻到膜外表面 胞质：蛋白酶（caspase）活化，发生级联反应（cascade），并伴随有能量消耗、新基因转录或蛋白质合成 胞核：细胞核内染色质DNA被核酸内切酶降解；从凋亡细胞中提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈梯状 （DNA ladder）三、细胞凋亡的关键调控分子 caspase家族Bcl-2 家族三、细胞凋亡的关键调控分子 线虫(Caenorhabditis elegans) 为细胞凋亡的研究作出了巨大贡献。 线虫在发育过程中，共产生1090个细胞，其中131个细胞发生凋亡。三、细

7、胞凋亡的关键调控分子 线虫中有11个基因与细胞凋亡相关，其中ced3 （cell death abnormal）和ced4基因是促进细胞凋亡，ced9基因抑制细胞凋亡。突变体ced3: 所有的 131 个细胞存活ced4: 所有的 131 个细胞存活ced9: 在胚胎发生过程中所有的细胞死亡哺乳动物中 ICE（interleukin-1 converting enzyme, 即caspase-1）， 为ced3的同源蛋白caspase家族半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase），其活性部位均含有半胱氨酸残基，

8、其切割位点为底物的天门冬氨酸残基后的肽键。哺乳动物中15种同源分子，其中7种参与细胞凋亡过程。根据其激活 方式及在细胞凋亡信号传递中的作用，分为： 凋亡起始酶（initiator caspase）：caspase2，8， 9，10 凋亡效应酶（effector caspase）：caspase3，6，7caspase家族caspase家族体内的存在形式：以胱天蛋白酶原（zymogen）的形式合成，呈低水平组成性表达。酶原主要由原结构域 (prodomain)、大亚单位(p20) 和小亚单位(p10)组成。caspase家族DED: death effector domain; CARD: ca

9、spase activation and recruitment domain caspase的活化同源活化（homo-activation）/自身活化（self-activation）：起始酶（initiators）的活化起始酶含有较长的原结构域，对其活性有抑制作用通过DED、CARD结构域与其它蛋白质相互作用形成二聚体/寡聚体而恢复酶活性caspase的活化caspase的活化异源活化（hetero-activation）：活化的起始酶催化水解效应酶将凋亡信号级联放大caspase cascadecaspase的活化caspase的效应机制效应性caspase可裂解多种底物蛋白：多种蛋白激

10、酶，如FAK (focal adhesion kinase)等。FAK的降解可使细胞丧失粘附能力，形成游离细胞核纤层蛋白，导致核纤层的解组装和核的皱缩细胞骨架结构蛋白，如微丝、中等纤维等，使细胞变形caspase的效应机制 效应性caspase可裂解多种底物蛋白：激活核酸酶，caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease，CAD）正常活细胞核酸酶CAD与其抑制物ICAD结合在一起处于无活性状态caspase可以裂解其抑制物ICAD而激活核酸酶CADcaspase的效应机制caspase的效应机制效应性caspase可裂解多种底物蛋白：

11、DNA修复酶，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（poly (ADP-ribose) polymerase, PARP）钙不依赖的磷脂酶A2 （iPLA2），生成溶血磷脂酰胆碱 （ LPC），招募单核细胞Bcl-2（B cell leukemia 2）是一种原癌基因；定位于线粒体外膜，可与胞质蛋白或同时锚定在线粒体外膜的该家族的其它蛋白相互作用；促进细胞存活（survival），抑制细胞凋亡，而不是促进细胞增殖（proliferation）。Bcl-2家族所有Bcl-2家族成员均含有14个保守的BCL-2同源结构域（BCL-2 homologue, BH），称为BH1 BH4。根据对细胞凋亡调节功能

12、的不同，将Bcl-2家族成员分为两类：抗凋亡的负调节因子；促进细胞凋亡的正调节因子Bcl-2家族Bcl-2家族的分类，Tait and Green, 2010Bcl-2亚家族： Bcl-2、 Bcl-xl、 Bcl-w、Mcl-1、A1，具有BH1、BH2、BH3和BH4四个结构域。定位于线粒体外膜，抑制细胞凋亡Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，具有BH1、BH2、BH3三个结构域，促进细胞凋亡的效应分子。需转位到线粒体外膜BH3亚家族：Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml，仅有BH3结构域，通过与抗凋亡的核心分子结合，而释放BAX、BAK等，从而促进细胞凋亡Bcl

13、-2家族四、细胞凋亡的信号通路细胞凋亡的外在途径（extrinsic pathway ）/死亡受体通路 由细胞膜上的死亡受体接受外环境中的死亡信号并迅速激活胞内胱天蛋白酶级联反应，使凋亡信号放大并传遍整个细胞，引起凋亡效应。死亡受体（ Death Receptor）属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族其中研究最充分的是FasL/FasR和 TNF-/TNFR-1系统。死亡受体（ Death Receptor）一种跨膜蛋白，包含一个富含半胱氨酸残基的胞外配体结合结构域、一个跨膜结构域以及一个胞内的由约80个氨基酸残基组成的死亡结构域 （death domain, DD）；死亡结构域可与具有死亡

14、结构域同源序列的蛋白质结合，在细胞凋亡信号的传递中起至关重要的作用。Fas介导的细胞凋亡信号传递途径DED, death effector domain 死亡效应结构域FADD, Fas-associated death domain, Fas相关死亡结构域蛋白DD, death domain, 死亡结构域死亡诱导信号复合体（ DISC）FasR招募的FADD一方面通过其C端的DD结构域与死亡受体相互作用，另一方面又可通过其N端的DED结构域与procaspase-8/procaspase-10分子N端的DED结构域结合，形成死亡受体-接头蛋白-procaspase-8/10组成的复合物，即死

15、亡诱导信号复合体 (death-inducing signal complex, DISC)，引发procaspase-8/procaspase-10的二聚化，发生自我剪切而活化。HIV 介导的细胞凋亡2. 细胞凋亡的内在途径（ intrinsic pathway）/线粒体通路 /应激通路 射线、化学物质等造成DNA损伤，氧化应激、内质网未折叠蛋白累积等应激因素，通过调控Bcl-2家族的凋亡调节蛋白，导致线粒体膜通透化，使线粒体释放一些细胞凋亡相关分子，并启动细胞凋亡的级联反应，引发细胞凋亡过程。四、细胞凋亡的信号通路BAX、BAK的活化是线粒体膜通透化的关键，BH3亚家族蛋白被诱导表达或激活

16、后，可与BCL-2家族的抗凋亡核心蛋白质结合，从而解放出BAX、BAK，或者通过直接作用于BAX、BAK，调控其活化，使其寡聚化，形成蛋白质孔道，引起线粒体膜通透化，促进细胞色素（CytC）的释放，激活caspase cascade，促进凋亡。Bcl-2家族与线粒体膜的通透化细胞凋亡的内在途径凋亡信号刺激细胞引起：线粒体膜通透性增加；跨膜电位（）下降；膜孔变大，导致线粒体膜间隙内的凋亡介导因子（如：细胞色素C）释放。细胞凋亡的内在途径CytC胞质中的Apaf-1因子（细胞凋亡蛋白酶激活因子1，apoptotic protease activating factor 1）脱氧三磷酸腺苷多个Pro

17、caspase-9 形成一个活化的凋亡体（apoptosome)。细胞凋亡的内在途径凋亡体使procaspase-9被水解形成有活性的caspase-9，再进一步活化下游的效应性caspase的级联反应，并水解相应的底物，引发细胞凋亡。细胞凋亡的内在途径五、凋亡细胞的检测1. 细胞形态学检测2. DNA片段化3. 细胞膜的改变4. 线粒体分析5. caspase活性及其底物的生化分析五、凋亡细胞的检测细胞形态学检测 电镜： 荧光染色：常用的DNA特异性染料：Hoechst 33342，DAPI 五、凋亡细胞的检测2. DNA片段化：细胞核内染色质DNA被核酸内切酶降解; 从凋亡细胞中提取的DN

18、A在琼脂糖凝胶电泳中呈梯状（DNA ladder）。 Ca+apoptosisExternalization of PS Ca+ Ca+ Ca+PSFACS analysis磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，凋亡时，可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。五、凋亡细胞的检测3. 细胞膜的改变FITC-Annexin-V-Fluorescence流式细胞术检测PS外翻PI Fluorescence五、凋亡细胞的检测4. 线粒体分析 正常

19、细胞：线粒体跨膜电位存在， 亲脂性阳离子荧光染料：Rhodamine 123等结合到线粒体，染料聚集，表现出特有的荧光； 凋亡细胞：染料弥散在细胞质中五、凋亡细胞的检测5. caspase活性及其底物的生化分析： Western blot 免疫沉淀 免疫组化 对PARP底物的剪切 利用荧光标记的底物检测caspase的活性caspase活性的检测正常：caspase-3以酶原（32KD）形式存在于胞浆，凋亡早期：被激活，其活性形式由两个大亚单位和两个小亚单位组成。六、 细胞凋亡的生物学意义确保正常个体发育维持组织、器官功能保持内环境稳定 个体发育过程中，清除机体内不需要的结构六、细胞凋亡的生物学意义蝌蚪变成青蛙的过程中尾巴的消失六、细胞凋亡的生物学意义 人手的发育过程伴随着细胞的凋亡 个体发育过程中，组织结构的塑造六、细胞凋亡的生物学意义调控细胞的数目 ：大鼠视觉系统的发育过程中，清除神经轴突出现错误连接的细胞 六、