一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件研究(共7页)

1、一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件(tiojin)研究植酸酶(phytase)也称肌醇六磷酸(ln sun)酶(myo - inositol-hexaphoshate phosphohydrotase)，它是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸（或者磷酸盐）一类酶的总称，分为(fn wi)两类，一是3一植酸酶(EC 3.1.3.8)，二是6一植酸酶(EC 3.1.2.6)，是一种新型、绿色环保的饲料用酶。由于动物的消化道不能吸收植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入环境，造成水域的富营养化污染。植酸酶可释放植酸中的磷，提高动物对磷的吸收利用率，减少排泄物中有机磷的含量。目前，对酸性植酸酶研究较多，

2、它仅适用于单胃动物畜禽和少数鱼类（如虹鳟等），但不适于消化道为中性的鲤科鱼类，因此对中性植酸酶缺乏较深入的研究。鉴于此，我们从土壤中筛选出产中性植酸酶的高产菌株，对其菌株的培养和分泌中性植酸酶的条件进行了初步研究，为扩大中性植酸酶在饲料工业中的应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂植酸酶菌株分离样品：样品为将采集于威海郊区玉米地肥沃土壤中的植酸酶菌珠与麸皮、发芽小麦混匀并放置20余天后的混合物。试剂(shj)：植酸钠p - 0109（Sigma公司），植酸钙（湖北三鑫生物工程有限公司），其他试剂均为国产分析纯。细菌营养肉汁(ru zh)平板培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、Na

3、C15g/L、琼脂15-20 g/L,pH 7.0。植酸钙筛选(shixun)平板培养基：葡萄糖20g/L、CaC122g/L、NHaN035g/L、KC10.5g/L、MgS047H200.05g/L、Fe-S047H200.01g/L、MnS04 H200叭g/L、植酸钙lg/L、琼脂15g/L，pH 7.0。产酶培养基：可溶性淀粉40g/L、胰蛋白胨10g/L、NAN028.6g/L、NHaN035.0g/L、K2HP040.10g/L、KC10.10g/L、MgC120.10g/L、MnC120.09g/L, pH 7.0.1.2方法产中性植酸酶菌株的筛选：将土壤样品稀释后均匀涂布到筛

4、选的培养基培养，3-4d后将产生透明圈的菌株接种于营养肉汁平板培养基，划线分离；挑选单菌落接种于筛选的培养基培养，3-4d后测量直径比（直径比=透明圈直径菌落直径）；选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基保存。挑取上述初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30、120-150r/min摇振培养24h后，按10%接种量接种于100mL的产酶培养基，30、150r/min摇振培养5d，每24h取5mL培养液，3000r/min离心去菌体，上清液利用截留分子量为I0000U的透析袋在去离子水中透析3-4h，得到去除无机磷的酶液用于酶活性测定，根据酶活力大小对菌株进行复筛。培养条件对产酶的影响：分

5、别采用不同(b tn)的发酵温度、接种量、培养基初始pH和装液量，经培养后测定发酵液酶活，找出最佳培养条件；更改培养基碳氮组成，以找出最佳碳氮源。酶活测定方法：采用硫酸亚铁一钼蓝法测定酶活l 6。酶活性单位(U)定义(dngy)为：在一定条件下，每分钟释放出1 nmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位，用U表示，单位为nmol/min。2结果(ji gu)与分析2.1菌株筛选土样经过筛选培养基涂布、富集培养、多次划线分离、点种筛选，共初筛出21株植酸酶产生菌。然后，再筛选出其中透明圈与菌落直径比值较大的10株（以phy代表植酸酶菌株），在30、150r/min振荡下分别进行发酵培养24h，测定

6、其发酵液酶活力大小。结果见表l。由表1可见，所筛选出的10个菌株的透明圈与菌落直径比均在1.9-2.5之间，得到酶活大于100IU/mL的菌株有2株，即菌株phy7和phylO。phyl0经16SrDNA序列测定与分析，得到该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)，且从系统发育树得出该菌归属绿脓假单胞菌2.2中性植酸酶产酶发酵(f jio)条件以phyl0为实验(shyn)菌株进行产酶条件研究。培养基起始pH对产酶的影响：配制(pizh)不同起始pH值(4.09.0)的液体发酵培养基，30、150 r/min、10%的接种量振荡培养24 h后测定其发酵液酶活，结果见图1。从图l可见，pH为

7、4.0-5.0时产酶增长最快，pH为5.0时产酶量最多，pH为6.0之后时产酶量迅速下降，因此确定最佳培养基起始pH为5.0。发酵温度对产酶的影响：在20-40发酵温度下，150 r/min振荡培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图2。图2表明，发酵温度为30时产酶量最高，发酵温度为25和35时酶活都有所下降，发酵温度为20和40时产酶量最低，因此最佳发酵温度为30。接种量对产酶的影响：将种子液按3%、5%、7%、9%、11%的比例接入装有100 mL培养基的250mL三角瓶后，30、150 r/min振荡培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图3。图3表明，按7%的接种量产酶量最大；接种量3%

8、左右时，菌体生长慢，产酶量低。随着接种量的增加，产酶量相应增加，到接种量为7%后，随着接种量不断增大，产酶量有所下降，因此接种量为7%左右时较适宜。装液量对产酶的影响：在250mL锥形瓶中分别加入40. OmL、60. OmL、80. OmL、100. OmL、120. OmL、140. OmL优化的液体培养基，在上述优化的产酶条件下以150r/min振荡培养24h，测定发酵液酶活力，结果见图4。由图4可见(kjin)，随着发酵液体积的增加产酶量增加，但高于80. OmL后产酶量反而下降，可能与其产酶时需充足的氧气供应有关；装液量在80. OmL时产酶量最大，达到226.25U/mL。正交试验

9、(shyn)：根据单因素试验结果，设计接种量(A)、装液量(B)和起始pH的三因素三水平正交试验，结果见表2。表2表明，装液量的R值最大，说明它对产酶的影响大，为主要因素。起始pH的R值最小，说明它对产酶的影响小，为次要因素。3种因素对中性植酸酶产酶量影响顺序依次为：装液量接种量起始pH。直观分析得出最佳水平组合应为A283 C2，而该组合在正交试验中并未出现；利用组合A2B3C2验证试验结果，重复3次产酶平均值均大于表2中任一处理的结果，因此最佳培养基条件为30、100mL的装液量、7%的接种(jizhng)量、起始pH为6。2.3碳氮源对产酶量的影响(yngxing)不同碳源对产酶的影响(

10、yngxing)：以质量分数为4%的麦芽糖、壳聚糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮分别代替产酶培养基中的碳源，在30、150r/min振荡发酵培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图5。图5表明，可溶性淀粉作为碳源，酶活最高，可达183U/mL，其他几种影响(yngxing)差异不大。不同氮源对产酶的影响：以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉、尿素、( NH4)2 S04- 7H20、NHaN03、NAN02分别代替产酶培养基中的氮源，以0.5%的NH4N03中的含氮量为标准来添加其他氮源，在30、150r/rain振荡发酵培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图6。从图6可见，用NaN

11、02作为氮源，酶活最高，活力单位可达218.6u/mL酶液；胰蛋白胨和NHaN03效果也较好，其他氮源酶活略低，较好的几个氮源顺序为：NAN02胰蛋白胨NH4N03牛肉膏。3结论从天然土壤中筛选出20余株产中性植酸酶活性的菌株，对一株产中性植酸酶活性较高的绿脓假单胞菌(Phyl0)进行了培养条件的优化。该酶在初始pH值6.0、发酵温度30、装液量100.0mL、接种量7.0mL、碳氮源分别为可溶性淀粉和NAN02条件下酶活最大，优化后酶活可达到231.2U/mL，比未优化前提高了2.16倍。作为一株尚未改良的原始菌株，其产植酸酶的能力较强，结果将为下一步酶的提纯及酶学性质研究打下了基础，今后可进一步通过基因工程或诱变育种手段提高菌种的产酶活力。朱