RNA功能及其研究进展演示教学

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNA功能及其研究进展-RNA功能及其研究进展摘要核糖核酸(RiboNucleicAcid简称RNA)由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。RNA能够充当“信使”,传递DNA(脱氧核糖核酸)上的遗传信息

2、,将其用于蛋白质的生产合成。研究显示,向生物体内注入微小RNA片段,会干扰生物体本身的RNA“信使”功能,导致相应蛋白质无法合成,从而“关闭”特定基因。科学家认为,采用RNA干扰技术直接从源头上让致病基因“沉默”,也许可以更有效地治疗某些疾病。前言RNA指ribonucleicacid核糖核酸，核糖核苷酸聚合而成的没有分支的长链。分子量比DNA小，但在大多数细胞中比DNA丰富。RNA主要有3类，即信使RNA（mRNA），核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）。这3类RNA分子都是单链，但具有不同的分子量、结构和功能。rRNA是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而mRNA、tRN

3、A在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质。在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。RNA

4、干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的HYPERLINK/view/201603.htmt_blank基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和HYPERLINK/view/107703.htmt_blank线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemicRNAi)

5、。RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)在分子层次上被证实是同一种现象。RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。关键词核糖核酸mRNAtRNArRNARNA干扰RNA种类及功能在生物体内发现主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。它们是信使RNA（messengerRN

6、A，mRNA）、转运RNA（tranferRNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）。RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3，5磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要46对碱基对

7、才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。细胞内有三类主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多58倍。mRNA生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA(messengerRNA，mRNA)。mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地

8、转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）。tRNA如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA转运RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬

9、运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40种以上。tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均约为27000（25000-30000），由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点，稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后，经过特殊的修饰而成的。1969年以来，研究了来自各种不同生物，:如酵母、大肠杆菌、小麦、鼠等十几种tRNA的结构，证明它们的碱基序列都能折叠成三叶草形二级结构，而且都具有如下的共性：5末端具有G（大部分）

10、或C。3末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。rRNA核糖体RNA(ribosomalRNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为

11、沉降系数（sedimentationcoefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合

12、。snRNA除了上述三种主要的RNA外，细胞内还有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。有的RNA分子还具有生物催化作用。上述各种RNA分子均为转录的产物，mRNA最后翻译为蛋

13、白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。RNA研究进展RNA干扰（RNAi）RNAi的定义目前对HYPERLINK/view/35842.htmt_blankRNAi(RNAinterference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因

14、导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。如果将其作为一门生物技术，则定义为：RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的。RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt23nt的小片段，使相应的基因沉默。RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型

15、缺失,属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。RNA干扰研究最近由于RNA干扰（RNAinterference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicerenzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNAseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RN

16、A的两个链都进行切割，酶切的产物3末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（smallinterferingRNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。有趣

17、的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析

18、成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。一个5端为两个2-O-甲基RNA、3端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是

19、利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的FasmRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRN

20、A，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制。葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。

21、总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。miRNA技术miRNAs定义miRNAmicroRNAs（miRNAs）是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRN

22、A碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNAs组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNAs在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。miRNA原理miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RANGTP和export

23、in5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。miRNAs研究目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNA