分子生物学第六章基因重组ppt课件

1、Chapter 6 Genetic recombination遗传重组重组recombination: 是已存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组：离散的染色体混合时产生新的组合。如真核染色体减数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。分子内重组同源重组homological recombination：同源性依赖，非序列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。位点特异性重组site specific recombination：序列专一性依赖，非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。转座transpositio

2、n：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非特异。不正常重组或非常规重组illegitimate recombination：很少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加工。与癌症相关。人工重组artificial recombination: 体外进行DNA的剪切和连接引起的重组，即基因重组。一、同源重组功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因导入模型：拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模板。如DNA修复。断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链间断裂、交

3、换和重新连接。如减数分裂时染色体交换杂合模型：包括上面两种特征。修复损伤DNA的同源重组真核生物同源重组的断裂与重接模型 Darlingtong D. C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重节，以消除张力，从而产生重组。 证据：姊妹染色单体的交换 Diploid eukaryotes: crossing over ( 双倍体染色体交换)Homologous chromosomes line up in meiosis (when)The nonsister chromatids exchange equivalent s

4、ections (what)同源重组发生在两条DNA双链之间重组酶能以任何的同源序列为底物重组的频率在整组基因中并不很频繁，但对整体和局部都有影响重组的总频率在精子和卵子中并不相同，在人类中女性是男性的两倍在整组基因内部，同源重组的频率与染色体的构象有关，例如，十字结构将阻止附近的DNA重组变异。染色体的重组包含部分的物理性的改变：破损与再联合细线期偶线期粗线期双线期终变期同化作用在DNA双链中制造一个破损两条DNA双链分子的联接作用是基因重组的关健环节同源染色体两对DNA双链在相应点产生nick，一条单链离开它的伙伴，与另一个双链分子的相应位置倒易位置，创造了两个DNA双链之间的连系，这种连

5、接在一起的一对双链叫做交差分子。一个链与另一个链的连接点叫做重组关节。重组关节能沿着DNA双链分子移动，这种移动叫做枝状迁移在一条链被另一条链取代的过程中，分叉点可以沿任一个方向移动交差分子旋转后形成一个平面结构-Holliday结构细菌基国重组中的单链同化作用 single-strand assimilationDNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同化。有三个必备条件：其中一个DNA分子必须有单链区其中一个DNA分子必须有自由3端单链区和3端必须设置在两分子互补区内RecA催化单链的同化作用RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段： RecA

6、在单链DNA上慢慢聚合。 单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异源双链连接 单链从双链中慢慢转移，产生一个长的异源双链DNA区带。SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA catalyzes single-strand assimilationRecA介导的DNA修复重组热点重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期产生，

7、在联会丝复合物形成阶断消失(60min)在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重组热点。Chi序列刺激它周围附近的重组与重组有关的基因称为Rec基因Rec突变体不能进行同源重组大约1020个与重组有关的DNA位点通过E. coli 的Rec基因突变体鉴定Chi序列能刺激它周围附近的重组： 5GCTGGTGG 3 3CGACCACC 5Chi序列在大肠杆菌中每510kb出现一次Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组中所起的作用便是提供带有自由3端的单链DNA。Haploid p

8、rokaryotes (单倍体生物原核同源重组）Between the two homologous DNA duplex (where) partially duplicated DNA of the chromosome between chromosomal DNA and “foreign” DNANicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD.RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.How: Holliday model 3.RecA-ssDNA f

9、ilaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).4.Seal the nicks and form a four-branched Holliday structure5.Branch migration & resolving Holliday junctionHaploid prokaryotes (原核同源重组）Haploid prokaryotes (原核同源重组）Resolving Holliday junction二、位点专一性重组非序列同源性重组位点特异由识别特异重组位点的

10、酶指导导致DNA序列发生重排 举例：l噬菌体插入细菌基因组l噬菌体从细菌基因组中切离l-encoded integrase (Int 整合酶): makes staggeredcuts交错切点in the specific sites （15bp seq）Int and IHF (integration host factor encoded by bacteria): recombination and insertionl-encoded excisionase (XIS): excision of the phage DNA Site-specific recombination: (

11、位点专一性重组）bacteriophage l insertion整合过程要求在attp和attB之间进行识别；而移除过程则需要在attL和attR之间进行识别重组过程是可逆的，但反应条件不同：整合反应需要int产物和IHF因子；移除反应还需要噬菌体xis基因产物。xis基因产物决定噬菌体是否进行复制 整合的过程: A. 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；B. Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间提，C. 在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。位点专一性重组的核苷酸序列1. att

12、P: POP:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列； P为-160 O的160bp序列 P为O 80的80bp序列 共240bp2. attB: BOB:B为-11 O序列 B为O 11序列 共23bp重组后形成BOP(attL,91bp)和POB(attR,171bp)特异性重组可以在体外进行特异性重组可以通过Int和IHF在体外进行，它包括在缺少任何DNA合成下的破损与再结合，两个臂的功能可以通过在两侧产生缺失来研究attp发挥作用要240bp，而attB只需要由-11到+11的23bp的片断即可发挥作用，在这个片段中，核心两侧只有4bp通路克隆系统gateway cloning s

13、ystem一种位点特异的DNA重组技术，包括LR和BP两个反应体系。可简单表示为： attBXattP attLXattR用途：PCR产物的定向克隆DNA片断高效、广泛的亚克隆氨基或羧基末端的融合蛋白表达LR反应和BP反应LR 反应：通路克隆的主要反应,LR 克隆酶(整合酶( Int) 和整合宿主因子( IHF) 蛋白)识别attL 和attR 重组位点后,催化入口克隆(entry clone) 的外源DNA 及其两端部分位点取代目标载体(destination vector) 的ccdB 基因及其两端部分位点(灰色) ,形成表达克隆(expression clone) 。BP 反应：与LR

14、反应反向, BP 克隆酶混和物(Int 、IHF 和切除酶(Xis) )催化表达载体attB 间的目的基因转到供体载体中,形成新的入口克隆,此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。PCR产物的BP反应三、转座重组特点：1.自身携带有转座酶基因，末端有反向重复序列 ;2.转座过程中出现共联体；3.转座以后,可以造成原来转座子位置的DNA缺失(非复制转座)，也可以依然保持在原位，而在靶序列上复制了一个转座子(复制转座);4.转座完成以后可以在靶序列上造成同向重复序列5.转座子插入后可影响所在位置的基因的表达转座子转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列。插入位置与转座子序列没有相

15、关性。病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中都含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。原核生物转座因子包括：插入序列；转座子；转座噬菌体IS element基因组的进化既赖于获得新的序列又赖于重排目前的序列。转座子可引起其它基因组顺序的重排，提供基因组里变异的主要来源。重排可以产生新的序列和改变目前序列的作用。细菌、噬菌体、病毒(尤其是逆转录病毒) 可以通过传染传递遗传信息。转座子的特征性结构是它的末端具有反向重复序列，而两侧宿主DNA的邻接末端是短的同向重复序列。当考查DNA序列时，这种结构类型是判断转座子的鉴别特征，并且是这种序列起源于转座作用的初步证据。转座因

16、子IS线型宿主DNA插入后引起目标序列产生同向重复THANK YOUSUCCESS2022/7/2239可编辑Tn10 插入环状DNA内Tn10 再移动时可能从两个方向移动，产生新的转座子Nonreplicative transposition describes the movement of a transposon that leaves a donor site (usually generating a double-strand break) and moves to a new site.Replicative transposition describes the moveme

17、nt of a transposon by a mechanism in which first it is replicated, and then one copy is transferred to a new site.复制转座非复制转座转座产生的效应Recombination between direct repeats excises the material between them同向重复序列之间重组造成重复间序列缺失 转座产生的效应Recombination between inverted repeats inverts the region between them. 反

18、向重复序列之间重组造成重复间序列倒位 Transposition is initiated by nicking the transposon ends and target site and joining the nicked ends into a strand transfer complex. 转座机制：在转座酶作用下，在转座子和目标序列的反式位点产生缺刻，转座子通过末端联会插入到目标序列中，形成共合体 Transposition may fuse a donor and recipient replicon into a cointegrate共合体. Resolution rel

19、eases two replicons复制子, each containing a copy of the transposon. 复制转座：在共合体分解时转座子产生两个拷贝 缺刻重组复制断裂重接则造成非复制转座Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion Each controlling element family has both autonomous and nonautonomous members. Autonomous elements are capable of transposition. Non

20、autonomous elements are deficient in transposition. Pairs of autonomous and nonautonomous elements can be classified in 4 families.Controlling elements 控制因子in maize form families of transposons 可用于转座子插入突变自主转座子非自主转座子The role of transposable elements in hybrid dysgenesis 杂种不育带有P因子P品系的精子DNA释放到卵细胞中时，精子基

21、因组上的P因子被激活，发生转座，引起突变The retroviral life cycle proceeds by reverse transcribing the RNA genome into duplex DNA, which is inserted into the host genome, in order to be transcribed into RNA.The retrovirus反转录病毒life cycle involves transposition like eventsLTR is an abbreviation for long-terminal repeat.自

22、然界中的其它基因转移与重组现象 一、接合作用(conjugation)二、转化(transformation)和转导(transduction) 三、转染(transfection)四、免疫分子的多样性接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的方式。一、接合作用(conjugation)转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 二、转化(transformation)转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导

23、作用转导(transduction)三、转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。思考题解释:recombination; single-strand assimilation; 同源重组在生命活动和基因工程中的作用是什么?同源重组的断裂重接模型的基本内容是什么?(提示:考虑断裂和重接的机制)位点专一性重组有哪

24、些主要特点?基因工程中是如何利用其原理进行基因克隆的?转座子的特征性结构是什么?转座可产生哪些的生物学或遗传学效应?自然界中存在哪些基因转移与重组现象?（至少写出5种以上）试比较同源重组、位点专一性重组、转座重组和人工重组间的异同点。四、免疫分子的多样性 体液免疫反应免疫球蛋白（Immunoglobulin）：高度特异性、庞大多样性L链（214aa）VL、CL和两种，对一个Ig唯一H链（426aa）VH、 CH1、CH2、CH3恒定区的序列有 、和五种类型VL和VH内有高变区真正抗原结合部位负责抗体分子对抗原的识别互补决定区CDRIgG、IgA、IgM、IgD和IgE （人体） 免疫球蛋白基因

25、的组织 Ig基因有三个独立的基因家族分别编码两个轻链（和）、 一个重链（小鼠 6、16和12号染色体） 轻链基因家族的组成：L、V、J、C四类基因片段 Lleader segment V variable segment Jjioning segment Cconstant segment 重链家族：L、V、D、J、C五类片段 Ddiversity segment 高变区 J和C之间有增强子 种系中基因数目变动较大 FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098人的重链基因簇包括了所有组织重链的基因信息（重链恒定区九种C片段、两个

26、假基因）家族V基因后跟随着几个以J片段作为前导的C基因k家族（人和老鼠）的组成： V 基因（人300、鼠1000 ）、5个 J（一个假基因）、 1个 C基因免疫球蛋白基因形成过程中的重组机制 除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因簇的结构都是 相同的种系结构 骨髓干细胞在分化为成熟B淋巴细胞时出现免疫球蛋白 基因的体细胞重排 即淋巴细胞中重组产生活性基因使免疫系统为基因组 的改变提供了广泛的基础 抗体分子的多样性1、轻链基因V和J片段的重组 a） 链的重组 每个C片段前有 J跟随 只发生一次重组 在V和J-C之间 (V和J的重组) b） 链的重组 基因簇只有一个C V与C之间 5个J（一个假基因） 用到的每个 J都可以成为 V的外元终端整合J右边的J片段作为含子被剪切整合J左边的每个J片段都会缺失掉 重链的可变 区由V和J基 因及第三个 D基因片段 编码 重链的可变 区重组有两 个阶段 D-J重组、 VH和DJ重组2、重链基因V、D和J片段的重组 一个指定的B淋巴细胞产生、其中之一轻链同重链结合 轻链中表现为同型性项斥（isotypic exclusion） 往往只有链基因重组失败，才发动链基因重组 抗体中大部分轻链是 链，链往往占少部分 人类有约60%的轻链是链，约40%为链。老鼠有95% 的B细胞表达类型的轻链 单特异性单个B细胞只产生一种抗体基因 淋巴细胞为二倍体H、