《卫生化学》课件14.色谱

1、第一部分 色谱法 第一章 色谱法引论 第一节 概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分 离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来第一节 概述 的含义，但仍被人们沿用至今。在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相 ；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 ；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。当流动相中样品混合物经过固

2、定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用第一节 概述 下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度，可将色谱法分类如下： 1. 按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），第一节 概述 又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。 随着

3、色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）.第一节 概述2. 按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。第一节 概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的

4、分离。 层析法一 色谱的起源，发展，分类 1931年,Kuhn卵黄(叶黄素) 黄体素+玉米黄质素 1941年, Martin,分配柱层析 1944年, Martin,纸层析 1952年, James, 气相色谱法 1956年,Stahl,薄层层析法 1967年, 高压液相色谱法 固定相 流动相 差速迁移 色谱法的分类: 流动相 : 液体：液相色谱法 气体：气相色谱法 固定相 : 固体 液体 按两相所处的状态分： 固定相 固体 液体流动相 液体 L- SC L- LC 气体 G- SC G - LC 按层析过程的机理分： 吸附层析： L-SC 分配层析： L-LC 按操作形式分： 柱层析 纸层析

5、 薄层层析二色谱法的基本过程 三 色谱法的基本原理：差速迁移2 液相柱层析法 : 吸附柱层析 分配柱层析一. 吸附柱层析（一) 基本原理： 吸附力不同 保留时间不同 差速迁移 分离（二) 分离过程（三) 吸附等温线在一定的温度下，一个组分在吸附剂上的吸附规律，可以用在平衡状态时此组分在两相中的浓度关系曲线图来表示，这叫做吸附等温线。 图9-2三类等温线与相应的色谱峰 （四） 吸附柱层析的固定相 吸附剂1. 对吸附剂的要求（基本要求） 应具有较大的吸附表面和一定的吸附能力（这种吸附应是可逆的，有利于组分的分离); 与流动相和样品中各组分不发生化学反应（包括不相溶）; 吸附剂的颗粒应有一定的粒度且

6、均匀,常用目数表示，目数越大，颗粒越小。2. 吸附剂的种类和选择性 极性吸附剂: 酸性吸附剂：硅酸（分离酸性物质） 碱性吸附剂：氧化铝（分离碱性物质） 非极性吸附剂：活性炭 （分离高分子化合物） 3. 常用的吸附剂及其活性 硅胶 酸性 氧化铝 中性 见吸附剂表 碱性 活性炭 液-固色谱中可用的固定相（按活性增加次序）: 1蔗糖 5滑石 9磷酸钙 13硅酸镁 2淀粉 6碳酸钠 10碳酸镁 14氧化铝 3旋复花粉 7碳酸钾 11氧化镁 15活性炭 4柠檬酸镁 8碳酸钙 12硅胶 16 漂白土 4.吸附剂的线性容量： 吸附剂的比表面积; 吸附剂的活性:活性越强,线性容量越小,故常用去活性来增大线形容

7、量。 （加水） （五）吸附柱层析的流动相 洗脱剂1.对流动相(洗脱相)的基本要求: 纯度合格;与样品、吸附剂不发生化学反应;能溶解样品组分,且粘度小易流动,不致洗脱太慢保持柱效的稳定性(即不能有损柱效,也不能改变柱的保留特性)；对样品的回收率没有干扰,即溶剂易蒸发除去。 2.洗脱剂的选择 ： 依相似者相容的原理常用的流动相的极性递增次序:石油醚环己烷 CCL4苯甲苯氯仿醋酸乙醚正丁烷丙酮乙醇水二.分配柱层析.对固定液的要求: 选择性高 化学稳定性好 蒸气压低,热稳定性好 粘度低 溶解度好(一) 分配色谱的基本原理及分离过程被分离组分在两相间的K=Cs/Cm不同来分离(二) 分配色谱的固定相和流

8、动相,两相的选择:两相极性应相差较大,彼此不能互溶样品中被分离组分在两相中的溶解度要足够高分配色谱的两种方式正相分配色谱(常规) ： 极性较强的溶剂为固定相 极性较小的溶剂为流动相反相分配色谱: 与正相相反 第三节 平面色谱法比移值第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相一、固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯

9、基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相两类。1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。2. 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗 第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速

10、率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相 的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作

11、流动相，以达到最高灵敏度。（3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第四节 液固色谱法 液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表

12、层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。 吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，第四节 液固色谱法易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。一、液固色谱法固定相

13、液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化第四节 液固色谱法镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。 各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。 三、液-固吸附色谱流动相 液相色谱的流动相必须符合下列要求： （

14、1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。 （3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。第四节 液固色谱法 （4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。 （5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。 在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。第五节 液液色谱法 液液色谱又称液液分配色谱。 在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个

15、液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。 以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。第五节 液液色谱法一、固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 40m的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻

16、土等材料制成，直径30 50 m的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小， 第五节 液液色谱法所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如， 氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。二、流动相 在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两 个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动

17、相第五节 液液色谱法通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正相分配色谱，适合于分离极性化合物； 反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。第六节 化学键合相色谱 将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。 70年代

18、初发展了一种新型的固定相化学键合固定相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几第六节 化合键合色谱法乎所有类型的化合物。 根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。一、

19、化学键合固定相法 化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、第六节 化合键合色谱法干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相 将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）键合相 如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。第六节 化合键合

20、色谱法可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。（3）硅碳型（=Si-C=）键合相 将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。第六节 化合键合色谱法二、反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。 目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种

21、观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。 分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。第六节 化合键合色谱法 吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使

22、它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。 一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分配。第六节 化合键合色谱法的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。三、正相键合色谱法 在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的

23、极性第六节 化合键合色谱法溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。 一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。 该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。第六节 化合键合色谱法四、离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学各种离子交换基团如-SO3H , -CH2NH2 , -COOH , -CH2N(CH3)Cl等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样

24、，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。化学键合色谱具有下列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以第六节 化合键合色谱法 通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。第七节 离子交换色谱法 离子交换色谱以离子

25、交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。一、固定相 离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式：一是常见的纯离子交换树脂；第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；第三种为大孔径网络型树脂。第七节 离子交换色谱法 典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在4 16%范围内，高度交联的树脂较硬而

26、且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为-SO3-H+ ，其中-SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分，H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。 第七节 离子交换色谱法 阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。二、流动相 离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的

27、选择性，并改善样品的溶解度。第八节 排阻色谱法 排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。 排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积

28、很第八节 排阻色谱法小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 排阻色谱的固定相一般可分为 软性、半刚性和刚性凝胶 三类。 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。第八节 排阻色谱法（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。（3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。 第九节 色谱分离方法的选择 要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，