第34章DNA和修复课件

1、第34章DNA的复制和修复12分子生物学的中心法则(central dogma) DNA RNA 蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制3一、DNA复制 （一）半保留复制（semiconservative replication） 模板原则特点亲代DNA双链，每股链都可作为模板按碱基配对原则指导新链合成合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链4亲代DNA子代子代半保留复制新链5Old strandNew strandThe hypothesis ofsemiconservativereplication proposed by Watson

2、 and Crickin 1953.6Radioisotope labelingand density gradientcentrifugation clearlydistinguishes replications ofsemiconservative from conservative.（1958）78910A electron micrograph of the replicationintermediate of a plasmid DNA: -shaped structures were observed; no single strandedDNA is visible.No co

3、mplete unwinding of the two parental strands occurred before the daughter strands are synthesized11（二）半不连续复制 （semidiscontinuous replication）1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶2、 前导链与随从链（岗崎片段）12553355335533 前导链随从链岗崎片段半不连续复制13前导链（leading strand）： DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）14随从链（lagging

4、 strand): DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。（复制方向与解链方向相反)岗崎片段（Okazaki）岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链15 DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5 3方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。16（三）RNA引物DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合需要具3-OH的引物引物最后被DNA聚合酶除去、补满，再由连接酶连接RNA聚合酶能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合减少突

5、变，提高DNA复制的真实性1755335533 前导链随从链岗崎片段RNA引物3-OH18严格的碱基配对规律RNA引物聚合酶的选择作用复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能DNA损伤的修复机制（四）复制的真实性19(五）参与DNA复制的酶类和蛋白质dNTPMg+3-OH引物DNA模板酶和蛋白质因子DNA链合成的条件：20DNA聚合酶/解旋酶单链结合蛋白(SSB）拓扑异构酶/引发体DNA连接酶酶和蛋白质因子2122231、DNA的聚合反应24252、大肠杆菌DNA聚合酶（原核生物）3,5-磷酸二酯键35图12-4包括5种DNA聚合酶: pol、26DNA聚合酶多功能酶 5 3外切酶 3 5外切

6、酶 5 3聚合酶单链多肽（Zn2+） 大小二个片段切除RNA引物 填补空缺 损伤后修复DNA聚合酶多功能酶 5 3聚合酶 3 5外切酶 不对称二聚体单体1-前导链/单体2-随从链DNA复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性2728 3 5 5 3 外切酶 聚合酶NC 5 3外切酶小片段35KD大片段（ klenow片段）68KD切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）（1）、DNA聚合酶（DNA Polymerase） Kornberg酶、DNA指导的DNA聚合酶 （DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）聚合功能29Large（Klenow）fr

7、agment of DNA pol 303132DNA pol 合成速度太慢持续合成能力低影响DNA复制的基因突变与DNA pol 无关仅参与局部修复，不是真正的复制酶33（2）、DNA聚合酶全酶（DNA Polymerase holoenzyme）10种亚基组成，含锌2 (4个)DNA聚合酶全酶核心聚合酶连接两个核心聚合酶夹钳装置复合体星环状,容纳DNA双链34Sliding clamp subunits聚合酶活性聚合酶活性3 5 外切活性 复合物，促进亚基结合于DNADNA pol III （复制酶） 无5-3 外切酶活性 组成核心酶促进核心酶形成二聚体组装2 353637真核细胞的DNA

8、聚合酶五种DNA 聚合酶DNA聚合酶和PCNADNA聚合酶DNA聚合酶、引物的合成前导链、随从链合成参与线粒体DNA的合成参与DNA的修复增殖细胞核抗原（ 类似于亚基）38（3）、DNA聚合酶、DNA聚合酶 5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 DNA聚合酶和(1999年以后发现） DNA受严重损伤时诱导产生 跨越受损部位 使复制缺乏准确性（修复酶）393、DNA解旋酶及SSBDNA解旋酶（helicase）单链结合蛋白 (SSB） 解开DNA双链每对碱基消耗2个ATP维持单链状态 使其不受核酸酶水解避免单链DNA自身发夹螺旋形成使前端螺旋易解开大肠杆菌SSB与DNA结合具有协同效应404、DN

9、A拓扑异构酶Linking number两条链的互绕数414243444546474849含拓扑异构酶（及H1） 与DNA复制及转录有关50拓扑异构酶/ （topoisomerase） 拓扑异构酶/ 旋转酶 （gyrase）切断DNA双螺旋中一股，张力下降后封闭消除负超螺旋不需能量切断DNA双链引入负超螺旋需ATP供能（1）、大肠杆菌的拓扑异构酶51磷酸二酯键的转移52535455拓扑异构酶拓扑异构酶 类型 ：切断DNA双螺旋中一股；不需能量拓扑异构酶/消除正/负超螺旋消除负超螺旋消除正/负超螺旋不能导入负超螺旋（2）、真核细胞的拓扑异构酶565、引物酶和引发体DNA聚合酶只能在模板链的指令下

10、，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，没有从头合成活力；引物酶合成一小段RNA，作为DNA合成的引物；必须与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物的活性。 如：DnaA、DnaB、DnaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等57586、DNA连接酶催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成3OH553 OO- P O O-有缺口的DNA链DNA连接酶ATPAMP+PPi OO P O O-53缺口封闭59哺乳动物：ATP供能， 大肠杆菌：NAD供能， 都需要Mg2+606162缺口填补:连接双股DNA分子中一链的切口双链DNA分子中双链的切口不能连接二分子单链DNA 63（

11、1）岗崎片段之间的连接（2）DNA损伤修复中的连接（3）一种重要的工具酶: 限制性内切酶切割后形成的粘性末端 或平头末端的连接应用:6465（三）DNA复制的过程(起始、延伸、终止） 确定复制的起始点解开双链DNA,提供单链DNA模板形成复制叉DNA合成的起始和延长形成带有新合成的DNA片段的复制泡复制的终止66原核生物双向复制（型复制）特定起始点：oriC真核生物多个复制单位（复制泡）（复制起始点+复制叉）多个起始点1、复制的起始67大肠杆菌复制起始点oriC的结构（1）9个核苷酸的重复序列4个（2）13个核苷酸的重复序列3个68形成起始复合物类组蛋白69 DNA的甲基化与复制的发动有关Or

12、ic中含11个GATCDam甲基化酶使A上N6甲基化（亲代）半甲基化的Oric可与细胞膜结合70 原核生物双向复制（型复制）71真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）7273DNA双链复制起始点 dnaAdnaB/dnaCDNA双链解开成单链DNASSB引物酶RNA引物/3-OHDNA聚合酶dNTP和3-OH形成3，5磷酸二酯键解旋酶SSBSSB3355引发体解旋酶拓扑异构酶74（1）.DNA聚合酶的作用（2）.前导链合成1000-2000个核苷酸后，（3）.随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌） （4）.Pol为不对称二聚体： 一个作用于前导链 另一个作用于随从链(

13、loop)2、复制的延伸75后滞链中引物不断被合成76777879808182383843、复制的终止去除RNA引物补充空缺连接 DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶DNA连接酶853553868788（七）真核细胞端粒DNA的复制真核生物的线性染色体DNA 每复制一次，子链5有缺失末端有特殊序列-端粒特征: 由数百个串联重复的6核苷酸组成人:5-AGGGTTAGGGTT-3端粒能稳定染色体1.端粒(telomere)89二十世纪三十年代，遗传学家Barbava McClintock和Hermann J.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染

14、色体结构和功能的特殊成分。如缺少染色体间会互相粘连、出现结构变化或其它错误行为，以致影响染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。“端粒”（telomere）90 希腊语末端“telos”和部分“meros” 端粒 telomere 端粒帽 染色体 端粒帽911978年首次发现四膜虫端粒的分子组成： 端粒 染色体DNA 端粒n（CCCCAA）n（GGGGTT）35（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）35（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子组成：92线形DNA复制末端问题933553RNA引物水解端粒 染色体DNA 端粒94 组成蛋白质(DN

15、A聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一携带RNA模板的逆转录酶人端粒酶:模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5合成(DNA): 5-AGGGTT-3端粒酶和衰老、肿瘤有关2.端粒酶（telomerase)95DNA末端1.RNA和DNA单链互补序列识别结合2.以RNA为模板 的逆转录过程3.再发动新一轮的合成延长,合成较长的重复序列3.端粒酶的作用机制3、端粒酶的作用机制96TTGGGGTTGGGGTTGGGG55TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC 35oH35CCAACCCC35TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合 1. 结合

16、3.移位 爬行模式端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC97末端补齐机制：5GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶535DNA聚合酶9899100以延长的DNA单链为模板,3-OH为引物合成富含C的互补链101 端粒帽 染色体DNA 端粒帽n（CCCCAA） （TTGGGG）nn（GGGGTT） （AACCCC）n35端粒结合蛋白保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合102人类纤毛虫类103哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构,环状DNA+蛋白质 保护染色体末端的稳定端粒的环状结构104端粒酶与细胞存亡端粒酶端粒 端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞

17、分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。105 正常细胞：细胞分裂细胞分裂 衰老死亡 细胞年轻化 端粒酶 重新引入抗衰老10655端粒消耗端粒维持细胞衰老细胞永生化染色体DNA端粒端粒107DNA修复的基础： 一条链有损伤 修复酶切除 以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列二、DNA的损伤修复108109（一）造成损伤的原因自发因素物理因素化学因素紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐 C U5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂羟胺 C- A GG羟胺110DNA复制时碱基的错误配对罕见态碱基引起T-G、A-C错配N H NN H NNNN

18、NNNNNO H OO H NHO H OO H NHCH3CH3 烯醇式T酮式G酮式T烯醇式GT-G错配DNA自发损伤111C-A错配NH NN H N HN HNH HNH NHNNNNNNNNOO亚氨基式C亚氨基式A 氨基式A氨基式C112 环出效应引起碱基错配新合成链 TGGC TGGCA TGGCAATG 模板链 ACCGATAG ACCGTAG ACCGATAGAl l l l l l l l l l l l l l l l l 环出效应引起碱基缺失或插入新合成链 TTTT TTTT TTTTGAC 模板链 AAAAACTG AAAACTG AAAACTGl l l l l l l

19、 l l l l l l l lAA 新合成链 TTTT TTT TTTTTGAC 模板链 AAAAACTG AAAACTG AAAAACTGTT l l l l l l l l l l l l l l l113114115116117118羟胺（hydroxylamine，HA） 使C的化学成分发生改变，不能与G配对，而与A互补。经两次复制后，C-G对变换成T-A对。119（二）修复机制1、光修复 （低等生物）不需光复活酶需光复活酶（photoreactivation repair）嘧啶单体 嘧啶二聚体嘧啶单体 嘧啶二聚体 光复活酶（+） 蓝光280nm239nm120光复活/光修复光复活酶

20、识别TT 与之形成复合物吸收光能使TT解开成为单体酶从复合物中释放仅作用于UV形成的产物121 O6甲基鸟嘌呤直接被修复1221949年A.凯尔纳偶然发现灰色链丝菌等微生物经紫外线(UV)照射后如果立即暴露在可见光下则可减少死亡。此后在大量的微生物实验中都发现了这种现象，并证明这是许多种微生物固有的DNA损伤修复功能,并把这一修复功能称为光复活。1958年R.L.希尔证明即使不经可见光的照射，大肠杆菌也能修复它的由紫外线所造成的DNA损伤，而后又证明其他微生物也有这种功能,当时就把这种修复功能称为暗复活或暗修复。此后发现暗修复普遍地存在于原核生物、低等真核生物、高等真核生物的两栖类乃至哺乳动物

21、中，并证实暗修复包括切除修复和复制后修复两种。1968年美国学者J.E.克利弗首先发现人类中的常染色体隐性遗传的光化癌变疾病着色性干皮病(XP)是由基因突变造成的 DNA损伤切除修复功能的缺陷引起的。这一发现为恶性肿瘤的发生机理提供了一个重要的分子生物学证据,也使DNA损伤修复的研究进入了医学领域。123光复活酶已在细菌、酵母菌、原生动物、藻类、蛙、鸟类、哺乳动物中的有袋类和高等哺乳类及人类的淋巴细胞和皮肤成纤维细胞中发现。这种修复功能虽然普遍存在，但主要是低等生物的一种修复方式，随着生物的进化，它所起的作用也随之削弱。 124（1） 特异核酸内切酶切除 DNA聚合酶填补、修复 DNA连接酶连

22、接（2） 人体重要的修复方式 （3）缺乏UV特异核酸内切酶 着色性干皮病2、切除修复（excision repair） 125切除修复发生在复制之前核苷酸切除修复126 dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U尿嘧啶-N-糖苷酶腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤次黄嘌呤-N-糖苷酶烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去AP位点（apurinic/apyrimidinic site）聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力不高127碱基切除修复 DNA糖苷酶识别切除改变的碱基 核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接128DNA糖苷酶具特异性识别-DNA中的异常碱基

23、水解-异常碱基与脱氧核糖间糖苷键 使其脱落129130DNA碱基的组成为何是“T” ？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U DNA中T的存在增加遗传信息的稳定性 RNA中的U：数量多/半衰期短/经济131132133着色性干皮病患者的皮肤部位缺乏核酸内切酶，不能修复被紫外线损伤的皮肤的DNA，因此在日光照射后皮肤容易被紫外线损伤，先是出现皮肤炎症，继而可发生皮肤癌。另外，患者还可能同时伴有眼睛和神经的症状。 着色性干皮病首先表现为对日光的高度敏感，这个症状在出生后不到一岁就可能出现，也就是说患者经轻度日晒后就会皮肤

24、发红，出现雀斑样损害，甚至出现水疱，继而出现皮肤萎缩、变薄、毛细血管扩张、色素沉着和色素脱失、皮肤干燥、脱屑等，日久可引发皮肤的良性或恶性肿瘤，包括皮肤的基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、角化棘皮瘤、血管瘤和血管肉瘤等。肿瘤一般在10岁内出现，大多数患者在20岁前就发展为肿瘤期。134耗能的过程3、错配修复135136137 CH3 G A T C C T AGGT G A T C53 C T A G35GTCH3 CH3 G A T C C T AGGTMutHMutSMutL切口 CH3 G A T C C T AGGT 5 3CH3 G A T C53 C T A G35TGDNA解链酶

25、 核酸外切酶 SSBdNMPs CH3 G A T C C T AGGT 5 3DNA聚合酶 DNA连接酶dNTPs CH3 G A T C C T AGGCDNA错配修复的模型1381394、重组修复（recombinational repair）140二聚体后起始途径复制继续子链缺口经重组由母链相应片段填补 RecA 蛋白具有交换DNA链活力母链缺口再合成 二聚体未被去除而是逐渐被稀释复制后修复1415、易错修复DNA受到损伤或复制系统受到抑制SOS反应诱导修复系统：避免差错的修复（error free repair）易错修复（error prone repair）142SOS反应诱导缺乏

26、校对功能的DNApol、引起校对系统的松懈 RecA基因产物LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活）SOS系统开放：修复系统的酶表达 LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转143SOS反应 SOS基因紫外线激活Rec ALex A阻遏蛋白 与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质基因表达Lex A阻遏蛋白操纵序列DNA144145146（一）突变的类型点突变类型结果转换-同型碱基颠换-异型碱基启动子/剪接信号 影响整个基因功能编码序列 蛋白质功能改变中性变化 AA变化，功能不变静止突变 碱基变，AA不变三、DNA突变147缺失插入倒位一个碱基/一段核苷酸/整个基因一段原来没有的碱基/核苷酸序列

27、DNA链内部重组，一段方向颠倒148149（二）诱发基因突变的因素 根据突变发生的原因可将突变分为:自然条件下未经人工处理而发生的自发突变（spontaneous mutation）经人工处理而发生的突变诱发突变（induced mutaion）诱发突变的各种内外因素统称为： 诱变剂（mutagen）150 H NNHOBroNNHOBr OHHNNHOOCH3酮式5-BU 烯醇式5-BU 胸腺嘧啶1、碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU) 与G配对与A配对化学因素151烯醇式 5- BU与G的配对NNOBrO-HH-NH-NHNONN1525-BU引起的 A-T G-C 转换 A-T第一次复制

28、 A-TA-BU （酮式）第二次复制 A-BU（酮式） G-BU （烯醇式）第三次复制A-BUG-BUG-C突变A-T1532、碱基修饰剂脱氨剂：诱导碱基脱氨、点突变 亚硝酸钠、亚硫酸氢钠羟胺烷化剂AI与C配对脱氨CGU与A配对X仍与C配对脱氨脱氨154芳基化剂引起的DNA损伤可与DNA形成共价化合物 OH HO HO G NH 苯并芘苯并芘二羟环氧化物与鸟嘌呤加合物1553、嵌入染料诱发的突变一类较强的诱变剂 NNH2 H2N 原黄素的结构原黄素插入母链两个碱基之间，结果多一个核苷酸；插入子链两个碱基之间，正常碱基不能插入，结果少一个核苷酸后果：引起移码突变1564、紫外线和电离辐射紫外辐射

29、：产生相邻碱基二聚体，T=T最常见电离辐射：直接作用于DNA分子 间接作用（辐射产生的活性氧） 碱基损伤、糖环断裂、DNA链断裂或交联生物因素：可移动基因成分 插入或切断基因、病毒、转座子物理因素生物因素15715820下列关于大肠杆菌DNA连接酶的叙述哪些是正确的：A催化DNA双螺旋结构之断开的DNA链间形成磷酸二酯键B催化两条游离的单链DNA分子间形成磷酸二酯键C产物中不含AMPD需要ATP作能源15916插入或缺失碱基对会引起移码突变，下列哪种化合物最容易造成这种突变：A口丫啶衍生物 B5-溴尿嘧啶C氮杂丝氨酸 D乙基乙磺酸 E咪唑硫嘌呤17在对细菌DNA复制机制的研究中，常常用到胸腺嘧啶的类似物5-溴尿嘧啶，其目的在于：A引起特异性移码突变以