PCR-HLA演示教学

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。PCR-HLA-HYPERLINK/albums/529785/529785.htmll0$29752a9bc02726f5c9eaf4fao查看图片t_blankHLAHLA(humanleukocyteantigen，HYPERLINK/view/451839.htmt_blank人类白细胞抗原)系统是目前所知人体最复杂的HYPERLINK/view/126521.htmt_blank多态系统。自1958年发现(JeanDausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免

2、疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄清其系统的组成、结构和功能，阐明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。目录HYPERLINK/view/529785.html1#1一.人类白细胞抗原HYPERLINK/view/529785.html1_1#1_1本质及结构HYPERLINK/view/529785.html1_2#1_2遗传控制HYPERLINK/view/529785.html1_3#1_3HLA的生物学功能HYPERLINK/view/529785.html1_4#1_4对蛋白质抗原的处理与加工HYPERL

3、INK/view/529785.html1_5#1_5调节免疫应答HYPERLINK/view/529785.html1_6#1_6参与T细胞的分化HYPERLINK/view/529785.html1_7#1_7诱导同种免疫应答HYPERLINK/view/529785.html1_8#1_8医学价值HYPERLINK/view/529785.html2#2二.高级体系结构HYPERLINK/view/529785.html2_1#2_1简介HYPERLINK/view/529785.html2_2#2_2组成HYPERLINK/view/529785.html3#3三.高级汇编HYPERL

4、INK/view/529785.html1一.人类白细胞抗原HYPERLINK/view/529785.html1_1本质及结构HYPERLINK/view/529785.html1_2遗传控制HYPERLINK/view/529785.html1_3HLA的生物学功能HYPERLINK/view/529785.html1_4对蛋白质抗原的处理与加工HYPERLINK/view/529785.html1_5调节免疫应答HYPERLINK/view/529785.html1_6参与T细胞的分化HYPERLINK/view/529785.html1_7诱导同种免疫应答HYPERLINK/view/

5、529785.html1_8医学价值HYPERLINK/view/529785.html2二.高级体系结构HYPERLINK/view/529785.html2_1简介HYPERLINK/view/529785.html2_2组成三.高级汇编一.人类白细胞抗原本质及结构HLA是具有高度多态性的HYPERLINK/view/2297767.htmt_blank同种异体抗原，其化学本质为一类糖蛋白，由一条重链(被糖基化的)和一条轻链非共价结合而成。其肽链的氨基端向外(约占整个分子的3/4)，羧基端穿入细胞质，中间疏水部分在胞膜中。HLA按其分布和功能分为类抗原和类抗原。遗传控制HLA受控于称作人类

6、HYPERLINK/view/523418.htmt_blank主要组织相容性复合体(MHC)的基因簇。MHC定位于第6染色体短臂上。HLA类抗原的特异性取决于重链，由HLA-A、B、C位点编码；其轻链是HYPERLINK/view/213170.htmt_blank2-微球蛋白，编码基因在第15染色体。HLA类抗原受控于HLA-D区(包含5个亚区)，由其中的A基因和B基因分别为重链和轻链编码，HYPERLINK/view/903725.htmt_blank抗原多态性取决于轻链。以上各基因(名称为WHO命名委员会1975年修订)均系多态性位点(复等位)，且共显性。如果把MHC作为一个整体来看待

7、，其多态性则更为突出。保守地估计，至少存在1300个不同的单体型，相应地约有17107个基因型。这就是除同卵双生子以外几乎无HLA相同者的遗传基础，从而HLA可视作个体的“身份证”。HLA的生物学功能靶功能HLA类抗原分布于所有有核细胞。其抗原特异性在于肽链抗原决定簇的特定氨基酸顺序。这些抗原可被外来物质例如某种病毒或化学物质加以改变，当这些基因产物被改变之后，便成为自身HYPERLINK/view/2000143.htmt_blank免疫原，成为免疫排除的耙子。可见，耙功能的实质在于“识别自我”，以保证机体的完整性。因此，分布于所有细胞及其多态性这一特点十分重要。识别功能HLA的识别功能实指

8、在免疫反应中特有的协同作用。抗体在B细胞生成，但在多数情况下，需要巨噬细胞和T淋巴细胞参与。其过程是：抗原经巨噬细胞处理后，抗原信息传递给T辅助细胞，后者再将信息传给B细胞，使B细胞进而分化生成专一抗体。在这个过程中，T辅助细胞不仅识别致敏巨噬细胞上的抗原，同时也要识别巨噬细胞是否与其本身的类抗原相一致。就是说，只有巨噬细胞的单体型和T辅助细胞的单体型相一致时，T辅助细胞才被激活，从而使免疫反应在严密的遗传控制下进行。对蛋白质抗原的处理与加工HLA-I类分子：内源性抗原的递呈分子HLA-II类分子：外源性抗原的递呈分子调节免疫应答*形成MHC-抗原肽-TCR复合物，启动免疫应答*在TCR特异性

9、识别APC所提呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的MHC分*子，才能产生T细胞激活的信号*MHC限制性：免疫细胞间相互作用时，除细胞受体识别相应抗原决定簇外，细胞间还必须识别相应的MHC分子*MHC分子是T细胞活化的HYPERLINK/view/3673109.htmt_blank协同刺激分子：CD4-MHCII、CD8-MHCI*调节免疫应答强弱参与T细胞的分化诱导同种免疫应答医学价值与器官移植HLA的研究原初是在器官移植研究推动下开展起来的。HYPERLINK/albums/529785/529785.htmll0$3b6833f50dab0f1cbc3109b4o查看图片

10、t_blank相关课程书籍故此，HLA又称移植抗原。临床实践表明，HYPERLINK/view/1533107.htmt_blank同种异体移植(除同卵双生子外)的排斥应是成功率的最大障碍。在遗传学中，MHC是作为一个单位HYPERLINK/view/5634.htmt_blank孟德尔式传递的。因此，同胞之间可有HLA相同、半相同和不同3种情况。实践证明，HLA相同的同胞供者的HYPERLINK/view/443990.htmt_blank肾移植，90%以上效果良好；单体型不同的供者，效果明显下降；两单型皆不同者则很少存活。HLA本质和功能的揭示，为移植配型提供了重要的理论依据。可以说，器官

11、移植是当代医学一项重要成就。作为某些疾病的遗传标志1972年Russel第一个报告HYPERLINK/view/1011.htmt_blank银屑病(牛皮癣)患者携带HLA-B13或HLA-B17。此后陆续发现大量其它疾病与特定的HLA相关，其中，HYPERLINK/view/3430831.htmt_blankHLA-B27抗原见于大约90%的HYPERLINK/view/45451.htmt_blank强直性脊椎炎病人，以至使HLA分型具有了诊断价值，甚至，能较早地证实疾病亚型之间的临床区别，例如，寻常银屑病与HLA相关，而脓疱性银屑病则不然；青少年性HYPERLINK/view/2696

12、135.htmt_blank胰岛素依赖型糖尿病与HLA-B8、HLA-Bw15和HLA-B18相关，而晚期发作型糖尿病并无这种相关。因此，特定类型的HLA便成为某些疾病的遗传标志。例如，常染色体隐性遗传的HYPERLINK/view/1854276.htmt_blank肾上腺皮质增生症是由于21-羟化酶缺乏。应用HLA抗原多态性作群体关联分析和家系连锁分析，发现有两个羟化酶位点(21-OHA和21-OHB)与HLA-B、DR紧密连锁。依此，可用HLA作出产前诊断。在优生学中，可以根据现有资料，对某些疾病推算出孩子患病的相对风险率。另一方面，关于HLA与长寿的关系，亦形成一个研究热点。与法医HL

13、A因其高度多态性而成为最能代表个体特异性并伴随个体终身的稳定的遗传标志，在无关个体之间HLA型别完全相同的几率级低。法医学通过HLA基因型或表型检测进行个体识别以“验明正身”，同时因其单倍型遗传特征，也是亲子鉴定的重要手段。HLA高分辨型技术随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保证。骨髓与器官移植是治疗白血病、癌症等人类重大疾病的有效手段，而在移植过程中人类白细胞抗原（HLA），是决定移植排斥反应高低的重要因素。在进行骨髓和其它器官移植时，供者

14、和受者之间人类白细胞抗原（HLA）相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高；反之，就越容易发生排斥反应。虽然直系亲属间HLA完全匹配的概率较高，但是由于我国白血病患者多为独生子女，在骨髓库中寻找与患者HLA完全匹配的志愿者，成为发现供者的主要途径。目前我国骨髓库中的HLA分型数据多数是低分辨的，并不能确保供者和患者的HLA真正匹配，患者往往需要和多个低分辨匹配的志愿者进行高分辨复核才能找到真正合适的供者。有的患者与数十个低分辨匹配的志愿者进行复核后，发现他们均不是合适的供者，甚至有的患者只能在HLA部分匹配的情况下就进行骨髓移植，导致术后出现严重的排斥反应，需

15、要服用大量药物来维持生命。此外，高分辨率配型费用昂贵，如果捐髓者本人是中华骨髓库的注册志愿者，捐者和患者一次高配的费用是7200元(每人3600元)，如果捐者不是注册志愿者，费用则是10000元（每人5000元），如此高的检测费用患者通常难以承受。因此，必须尽快实现“高分入库”，从根本上降低检测费用，提高HLA配型效率。为改变目前落后的HLA匹配手段，目前通过高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保证。该方法应用新一代的测序技术，只需通过一次实验就能够读取数千份样本的HLA序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可发现新的等位基因。在检测通量、数

16、据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型，成本不到传统技术的一半，但真正做到了“低分价格，高分数据”，能避免多次配型给患者造成的额外经济负担，也为治疗争取宝贵的时间。最新HLA高分辨分型技术，使建立高分辨HLA数据库成为可能，不仅有利于快速准确地找到合适供者，大大地提高骨髓库的使用率，使其更好的服务于患者，而且可以为HLA的科学研究与技术创新提供基础性的数据支持。PCR生物学的聚合酶链式反应PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。

17、定义HYPERLINK/view/29641.htmt_blank聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction），HYPERLINK/albums/2764/5867797.htmll0$9dc3cf58f0bc34ba800a181bo查看图片t_blank聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由HYPERLINK/view/20616.htmt_blank高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增

18、,具有HYPERLINK/view/552529.htmt_blank特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于HYPERLINK/view/8563.htmt_blank基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无HYPERLINK/view/3687.htmt_blank细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含

19、量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室

20、技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。技术原理DNA的半保留复制是生

21、物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在HYPERLINK/view/29676.htmt_blankDNA聚合酶与启动子的参与下，根据HYPERLINK/view/352816.htmt_blank碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在HYPERLINK/albums/2764/5867797.htmll0$f29faa8faa51ccd5f01f36e5o查看图片t_blank聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP

22、就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性）-延伸三个基本反应步骤构成：HYPERLINK/view/575014.htmt_blank模板DNA的变性：模板DNA

23、经加热至94左右一定时HYPERLINK/albums/2764/5867797.htmll0$a1ad16fa953b7eac59ee90e7o查看图片t_blank聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在HYPERLINK/view/212575.htmt_blankTaqDNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按HYPE

24、RLINK/view/1017250.htmt_blank碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩HYPERLINK/view/141922.htmt_blank目的基因扩增放大几百万倍。反应特点1特异性强PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；TaqDNAHYPERLINK/view/1203504.htmt_blank聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正

25、确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶HYPERLINK/view/3847887.htmt_blank基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2灵敏度高PCRHYPERLINK/view/1301731.htmt_blank产物的生成量是以指数方式增加的，能将HYPERLINK/view/120051.htmt_blank皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g

26、=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在HYPERLINK/view/2584.htmt_blank病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在HYPERLINK/view/19168.htmt_blank细菌学中最小检出率为3个细菌。3简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用HYPERLINK/view/3853224.htmt_blank电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养

27、细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCRHYPERLINK/view/3366034.htmt_blank特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至1

28、0kb的片段。引物HYPERLINK/view/24576.htmt_blank碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或HYPERLINK/view/290331.htmt_blank嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好

29、处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10扩增HYPERLINK/view/901429.htmt_blank缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（

30、其中需要Mg2+)PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度TaqHYPERLINK/view/604366.htmt_blankDNA酶仍有较高的HYPERLINK/view/955294.

31、htmt_blank催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为HYPERLINK/view/1506824.htmt_blank高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、HYPERL

32、INK/view/3851766.htmt_blank碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：7080150核苷酸/S/酶分子7060核苷酸/S/酶分子5524核苷酸/S/酶分子高于90时，

33、DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少

34、。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的

35、关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和HYPERLINK/view/265194.htmt_blank蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它HYPERLINK/view/3872854.htmt_blank细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于

36、PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。工作步骤HYPERLINK/albums/2764/5867797.htmll0$34bbf8cdcd2587310eb34529o查看图片t_blankPCR反应的基本过程标准的PCR过程分为三步（如图所示）：1.DNA变性（90-96）：

37、双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（复性）（40-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（68-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。循环参数1、预变性（Initialdenaturation）模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一

38、般95加热3-5分钟。2、引物退火（Primerannealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在72进行（Taq酶HYPERLINK/view/3815325.htmt_blank最适温度）。延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全，并使单链产物退

39、火成双链。PCR-PCR常见问题电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日HYPERLINK/view/25110.htmt_blank电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂HYPERLINK/view/15472.htmt_blank蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的HYPERLINK/view/32445.htmt_blank组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性

40、不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做HYPERLINK/view/63549.htmt_bl

41、ank琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增HYPERLINK/view/1295893.htmt_blank产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应HYPERLINK/vie

42、w/274417.htmt_blank体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特

43、异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必

44、要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有

45、：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，HYPERLINK/view/44388.htmt_blank摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul2X连接液,50n